1、转植酸酶玉米安全性评价研究进展 谭燕华 谢翔 夏启玉 张丽丽 霍姗姗 张家明 郭安平 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 摘 要： 玉米种子含有丰富的磷, 但大部分磷以植酸磷的形式存在, 难以被猪和禽类等单胃动物利用。转植酸酶基因玉米是中国唯一获得安全证书的转基因玉米, 含有高浓度的植酸酶, 能够提高动物对植酸磷的利用率;减少排泄物对环境的污染, 具有商业化种植前景。转基因作物需要进行必要的安全评价。本文综述了近年来转植酸酶基因玉米安全性评价研究, 主要包括转植酸酶基因和目标蛋白的检测、食用安全性评价、环境安全评价及非预期影响的研究, 并对转植酸酶基因玉米应用及安全评价体系的发展作了展望。关
2、键词： 转基因玉米; 安全评价; 植酸酶; 作者简介：谭燕华 (1974) , 女, 副研究员;研究方向:转基因作物安全评价。作者简介：张家明, E-mail:;作者简介：郭安平, E-mail:收稿日期：2017-03-23基金：海南省自然科学基金 (No.20163123) Progress in Safety Evaluation of Phytase Transgenic MaizeTAN Yanhua XIE Xiang XIA Qiyu ZHANG Lili HUO Shanshan ZHANG Jiaming GUO Anping Institute of Tropical Bi
3、oscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences; Abstract： Maize is one of the most important feed crops in China and it is rich in phosphorus. However, most phosphorus is trapped in phytate phosphorus and which is difficult to be used by animals such as pigs and poultr
4、y. Phytase transgenic maize contains high concentration of phytase and can increase the phosphate uptake of animals, which is the only transgenic maize that has been officially issued with a biosafety certificate in China and has great potential in the animal feed industry. Genetically modified crop
5、s should carry out safety evaluation before commercial application. In this article, we mainly reviewed the safety evaluation of phytase transgenic maize in recent years, including phytase gene and protein detection, food safety evaluation, environmental safety evaluation, and unintended effects. Th
6、e application of phytase transgenic maize and the development of safety evaluation system were also discussed.Keyword： Transgenic maize; safety evaluation; phytase; Received： 2017-03-23玉米是我国重要的粮食和饲料用作物, 生产中每年大约 80%的玉米用于饲料行业。磷是动物生长发育不可缺少的元素之一, 玉米中含有丰富的磷, 但大部分的磷是以植酸磷的形式存在, 这种形式存在的磷难以被猪和禽类等单胃动物利用。因此, 能
7、够增加动物磷酸盐摄取的转植酸酶基因玉米, 对养殖业显得非常重要和有必要。植酸酶 (phytase) 是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的酶的总称, 是一种可使植酸磷复合物中的磷变成可利用磷的酸性磷酸酯酶。陈茹梅等用玉米胚特异性球蛋白-1 启动子在玉米种子中过表达黑曲霉 (Aspergillus niger) 菌株的植酸酶基因, 得到了含有高浓度植酸酶的转基因玉米, 其植酸酶活性达到约 2 200 U/kg 种子, 比非转基因玉米种子约增加了50 倍1, 完全能满足生产应用需要, 可以替代传统方式中用微生物发酵生产的植酸酶2。目前, 转植酸酶基因玉米是我国唯一获得安全证书的转基因玉米, 但还未
8、进行商业化种植。转基因作物商业化种植前必须进行必要的安全评价。近年来, 已对转植酸酶基因玉米安全性评价进行了许多研究。1 植酸酶基因玉米转化事件和目标蛋白的检测随着转植酸酶基因作物的开发和对转基因作物的监管要求, 需要准确地对产品进行验证3。为了对转基因作物目标基因进行检测, 已对转植酸酶基因玉米进行了定性、定量 PCR 检测技术方法的研究4-5, 农业部已于 2012 年颁布了植酸酶基因玉米定性 PCR 检测技术标准 (农业部 1782 号公告-11-2012) , 详细的方法见表 1。李俊等以真菌来源的植酸酶基因为研究对象, 建立了植酸酶基因的特异性检测方法, 可检测各种含有该基因的转基因
9、作物;同时还构建了阳性质粒分子 p BS Endogenousphytase, 可作为转植酸酶基因作物的检测阳性材料6 (图 1) 。酵母中表达和纯化的 phy A2 蛋白被糖基化, 其分子量约为 75 ku;去糖基化蛋白的分子量从氨基酸序列预测约为 55 ku;植酸酶蛋白在转基因玉米种子样品中显示的带约 60 ku1。对目标蛋白植酸酶蛋白的检测进行了 ELISA、Western blot、免疫亲和层析等多种方法的研究7-8。闫广为等用 60%80%硫酸铵分级沉淀植酸酶, 得到的植酸酶比活要比粗提液高 6.1 倍8。种子中提取的转植酸酶基因蛋白带在 SDS-PAGE 不分离1, 赵倩倩等用 8
10、0%硫酸铵沉淀植酸酶蛋白粗提液, 透析后再通过免疫亲和层析得到了在 SDS-PAGE 胶上单一条带的植酸酶蛋白7。Zhou 等开发了一种快速免疫层析侧流装置, 运用 4 种单克隆抗体 (EH10a, FA7, AF9a, 和 CC1) , 能够快速检测出转基因玉米中重组尼日尔曲霉phy A2 表达蛋白9 (图 2) 。2 转植酸酶基因玉米食用安全性评价对转基因植酸酶玉米进行食用安全性评价时, 首先比较了转基因植酸酶玉米与非转基因对照玉米营养成分的差异。转基因玉米与非转基因对照玉米相比, 在主要成分 (蛋白质、脂肪、氨基酸、淀粉、水分、灰分等) 、微量营养成分 (矿物质、维生素) 等方面, 没有
11、生物学意义上的差异, 具有实质等同性。但转基因玉米中植酸酶活性明显高于非转基因玉米, 非植酸磷含量比非转基因玉米高 1 倍10。Gao 等报道, 转基因植酸酶玉米与常规玉米相比, 植酸酶活性有显著差异 (p0.05) ;氨基酸分析显示 2 种玉米的氨基酸含量也相似 (p0.05) 。不过 2 种玉米在湿度上有显著性差异 (p0.001) 11。食用安全性分析显示, 转植酸酶基因玉米作为饲料喂养肉仔鸡, 对其生长性能12、血清生理生化指标、免疫器官发育及免疫功能13均无不良影响, 未出现“非期望效应”;对蛋鸡的产蛋性能和鸡蛋品质均无影响14-16。对长期 (50 周) 喂养植酸酶转基因玉米的蛋鸡
12、检测了食糜、血液、组织、和鸡蛋中的转基因和内源植物 DNA 片段和蛋白质, 分析发现 phy A2 基因和蛋白在消化道很快降解, 没有在血液、组织和鸡蛋中检测到 phy A2 基因和蛋白15。喂食转基因玉米比喂食非转基因玉米的猪含有着更容易消化和代谢的能量以及更高的的消化率17。饲粮中使用转植酸酶基因玉米有利于提高生长猪的生长性能14。因此饲喂转植酸酶基因玉米与常规玉米是同等安全的, 且转植酸酶基因玉米可提高单胃动物对日粮中磷的利用率, 从而减少日粮中无机磷的添加量, 节约磷资源, 降低磷的排出对环境造成的污染。表 1 转植酸酶基因玉米目标基因定性 PCR 检测方法 Table 1 Quali
13、tative PCR detection method of target gene for phytase transgenic maize 下载原表 图 1 植酸酶基因阳性质粒分子 p BS Endogenous-phytase 构建图6Fig.1 Construction of the positive plasmid molecule p BS Endogenous-phytase 下载原图图 2 Western blot 分析植酸酶蛋白1和 SDS-PAGE 检测免疫亲和层析纯化后蛋白7Fig.2 Western blot analysis of phytase protein1an
14、d SDS-PAGE of the purified protein by immunoaffinity chromatography7 下载原图A:Western blot 分析植酸酶蛋白。1 为对照种子, 2 为分子量标记, 3 为酵母表达的植酸酶蛋白, 4 为去糖基化的植酸酶蛋白, 5 为转基因玉米种子中表达的植酸酶蛋白。B:SDS-PAGE 检测免疫亲和层析纯化后植酸酶蛋白。M 为分子量标记, 1 为穿透峰, 2 为纯化后蛋白。A:Western blot analysis.The blot was probed with an antibody against yeast-expre
15、ssed phytase.Lane 1, non-transgenic seed control;lane 2, protein molecular weight markers;lane 3, yeast-expressed and purified phytase;lane 4, deglycosylated phytase that was expressed in yeast;lanes 5, transgenic seed.B:SDS-PAGE of the purified protein by immunoaffinity chromatography.M Molecular m
16、arkers.1, Penetration peak;2, Purified phytase.3 转植酸酶基因玉米环境安全性评价对转基因植酸酶玉米环境安全性评价的研究也是研究的热点。目前对转植酸酶玉米进行环境安全性评价的研究主要是花粉介导的外源基因漂移以及对生物多样性的影响;对生物多样性的影响包括对节肢动物生物多样性的影响以及对土壤微生物多样性的影响。转基因玉米花粉扩散的频率和距离受环境影响, 在不同日期、不同气象条件下, 花粉漂移扩散的距离不尽相同。赵宗潮等采用花粉染色法研究了转植酸酶基因玉米花粉的扩散频率和距离, 结果表明, 花粉扩散的风险概率在不同方位有不同, 扩散的频率随着距离增加而降
17、低;在试验期间花粉扩散的最远距离可达 35 m18。对田间节肢动物种群动态及多样性的影响研究表明, 转植酸酶基因玉米的种植未对田间主要害虫和天敌种群动态产生显著影响19-20;对亚洲玉米螟和棉铃虫的生长和营养利用均无影响21;对步甲物种多样性及常见物种没有明显影响22。对土壤生物的群落结构和多样性研究表明转植酸酶玉米的田间种植未对土壤线虫的生态指标和群落结构造成直接影响23。同一时期同一种微生物数量在种植转植酸酶玉米、非转基因玉米及空白土壤中基本相同24;对土壤酶活性的影响中土壤蔗糖酶、土壤蛋白酶及土壤脲酶活性均无显著影响;而对土壤酸性磷酸酶活性有显著影响, 转植酸酶玉米的土壤酸性磷酸酶活性显
18、著高于亲本非转植酸酶玉米的土壤, 这说明转植酸酶玉米显著提高了土壤酸性磷酸酶的活性, 进而对土壤中磷酸酯的水解会起到一定的促进作用25。4 非预期影响的评价转基因作物由于导入外源基因而使植物基因组发生改变, 可能会导致意想不到的影响, 从而影响人类的健康或环境26, 随着转基因作物的商业化, 这些非预期的未知影响是转基因作物生物安全研究的热点之一。评价非预期影响中, 高通量的“组学”技术比有目标分析评价具有优势27-28, 包括转录组学、代谢组学、蛋白质组学等。其中蛋白质直接参与代谢和细胞的生长, 多数外源基因的表达或调控产物是蛋白质29, 一些毒素、抗营养因子或过敏原等蛋白还可能对人体健康产
19、生很大的影响。因此, 从蛋白质组学上对转基因作物生物安全性进行非预期影响评价非常重要30。在转基因玉米的非预期影响研究中, 由于抗虫转基因玉米 MON810 在商业上的重要性, 其与对照的非预期影响已被广泛的研究, 分别从转录组学31-34、代谢组学35-38、蛋白质组学上39-42进行了比较研究, 结果表明转基因玉米MON810 在转录组水平、代谢水平、蛋白质水平上与其对照常规玉米具有实质等同性。我们对转植酸酶玉米进行了比较蛋白质组学研究, 获得了转植酸酶玉米叶片和种子的总蛋白 2DE 图谱, 其中叶片鉴定了 44 个差异蛋白, COG 功能分类表明这些差异蛋白主要与碳水化合物的转运与代谢相
20、关, 其次与翻译后修饰相关;KEGG分析显示差异蛋白主要是参与光合作用的碳固定途径43。利用 2DE-MS/MS 和i TRAQ 技术一共鉴定了 148 个差异蛋白, COG 功能分类表明差异蛋白主要是参与转录后调控与转录后修饰的蛋白44。与传统育种的作物相比, 转植酸酶玉米叶片与常规玉米叶片具有实质等同性, 转基因没有显著改变玉米的蛋白质组。5 展望转植酸酶基因玉米作为饲料用玉米在我国的推广使用有着极为重要的意义。目前对转植酸酶基因玉米进行的安全性评价主要是食用安全性方面的评价以及环境安全性评价, 且主要是针对特定目标进行可预期影响的评价, 结果显示转植酸酶玉米与非转基因对照玉米一样是安全的
21、。但对转植酸酶基因玉米从组学上进行的非预期影响的研究还很少, 我们从蛋白质组学上进行了比较分析, 还未见从转录组学、代谢组学层面上进行比较研究。因此还应加强对转植酸酶基因玉米非预期影响的研究。转基因作物的安全性评价是一项长期工作, 需要建立科学的评价技术体系进行长期跟踪监测。首先, 转基因作物的安全性评价应遵循个案的原则一个一个的进行。其次, 对转基因作物进行安全性评价时, 既要用目标分析法对其进行预期影响进行评价, 还应使用非目标的组学方法对其进行非预期影响研究。其中对转基因作物的生态风险及环境安全进行评价研究时, 在不同地区、不同土壤类型条件下, 需要分别进行长期定位监测。评价转基因作物的
22、非预期影响时, 还应结合多种组学技术, 包括转录组学、代谢组学和蛋白质组学技术等, 评价可以更全面、更客观41。参考文献1Chen R, Xue G., Chen P, et al.Transgenic maize plants expressing a fungal phytase geneJ.Transgenic Res.2008, 17 (4) :633-643. 2Gao C Q.Phytase transgenic corn in nutrition of laying hens:Residual phytase activity and phytate phosphorus con
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