1、体外诊断试剂的分类和基本原理,中国药品生物制品检定所,十六个体系考核类型分类表,我国体外试剂的几个发展阶段 1 七十年代末， 乳胶凝集，血球凝(PHA,RPHA） 2 八十年代初期，放射免疫测定(RIA)， 抗HBs单克隆抗体 3 八十年代中期，酶联免疫试剂，基因工程表达乙肝 病毒核心抗原和e抗原 4 九十年代， 聚合酶链反应(PCR)，丙肝，戊肝 病毒基因被克隆，各种基因工程抗 原被应用 5 近期， 发光免疫,生物芯片技术(基因芯片， 蛋白芯片),（第一类） 酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒子）类试剂,酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）； 癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法)
2、 化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒 增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测试剂盒 时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测定试剂盒 电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒 微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒,酶联免疫试剂,抗原抗体之间的特异反应与酶的高效催化反应有机的结合。固相 样品 放大 抗原 抗体 抗抗体-酶-底物-显色 抗体 抗原 抗体-酶-底物-显色,酶标板,样品中HCV 抗原,HRP 酶标记抗HCV抗体,抗 HCV 抗体,HRP酶,单克隆抗体,丙肝抗原 ELISA试剂,HIV-1 p24抗原检测试剂的原理,1 双抗体夹心法应用 HBsAg, HBeAg,
3、HBcAg, pres1, pres2 2 双抗原夹心法 应用 抗HBs，抗HIV 3竞争法 应用 抗HBc, 抗pres24 中和抑制法 应用 抗Hbe5 捕获法 应用 抗HBc IgM6 间接法应用 抗HCV, 抗HEV,几种主要的酶联免疫方法模式,发光免疫试剂,1.抗原抗体反应的基本原理及方法模式与酶联免疫试剂完全相同 2.检测光信号，其光信号可因酶催化而产生也可用其他方法使其产生,酶促化学发光,以酶为催化剂，通过氧化反应，使底物发光。过氧化物酶（HRP )促发光，底物鲁米诺碱性磷酸酶(AP )促发光，底物螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯（AMPPD),鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统（HR
4、P）,商业化产品中常见的化学发光系统（一）,鲁米诺及其衍生物的增强剂（Enhancer）,AMPPD及其衍生物的化学发光系统（AP）,光子(477nm),商业化产品中常见的化学发光系统（二）,非酶促化学发光及电化学发光,非酶促化学发光：以吖啶酯、过氧化氢为发光系统，不需要酶的催化。仪器成本高，技术复杂，尚未国产化（Abbott)电化学发光：氧化反应是通过电极上的电化学反应产生，标记物为三氯联吡啶钌。仪器成本高，技术复杂，尚未国产化。（Roche）,商业化产品中常见的化学发光系统（三）,吖啶酯化学发光系统 /非酶促,e-,TPA,TPA,TPA+,H+,e-,e-,Platinum electr
5、ode,Magnet,发光,Ru2+ 基态,Ru2+ 激发态,Ru3+,电化学发光法原理,在电场的作用下，三丙胺 （TPA） 被氧化成阳离子自由基TPA+，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的三联吡啶钌衍生物 Ru(bpy)33+，使其形成激发态的Ru(bpy)32+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。 激发态的Ru(bpy)32+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的Ru(bpy)32+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与Ru(bpy)32+的浓度呈线性关系，
6、故可测出待测抗原的含量。,时间分辨荧光,将三价稀土离子铕（Eu）等通过络合物标记到抗原或抗体分子上，通过检测铕等的荧光实现免疫分析应注意环境及样品中同类元素导致的本底干扰，特别是北方地区,时间分辨荧光增强原理,发光信号检测,光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD）,结构简单、性能稳定 但灵敏度低、线性范围较窄。,主要特点,原理：,光信号,光电转换器件,电压或电流信号,放大,单光子计数器是目前高灵敏度 发光分析仪的核心部件,光电倍增管,高压,高速放大器,高速比较器,高速分频器,发光样品 产生光子,激发光阴极 产生光电子,在阳极上形成较强信号,脉冲信号,相对发光单位 数字脉冲(RLU),在各打拿
7、极之间得到 能量和数目的倍增,流动池检测方式示意图,检测器,检测池,负压泵,废液,四通阀,冲洗液,样品管,计量泵,干燥空气,原位进样泵,氧化剂,优点：结构简单，运行成本低 缺点：明显的易产生交叉污染，工作效率受限。,常见进口发光免疫分析产品,（第二类） 胶体金（硒、乳胶）类试剂,胶体金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断试剂盒 胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒,胶体金试剂原理,硝酸纤维膜 加样检测区 对照区 (HBsAg)- 玻璃纤维膜- 抗HBs 羊抗鼠 鼠抗HBs,胶体金免疫层析法反应示意图,HIV胶体金类快速诊断试剂检测结果,第三类） 免疫印迹试剂,免疫印迹试剂盒: 风湿病自身抗体检测试剂
8、盒（免疫印迹法）,免 疫 印 迹 法 示 意 图,用于RR样品的HCV抗体确认独特的IgG（I/II）及hSOD内部质控设计用于检测的固相化抗原重组表达蛋白：c33c，NS5合成肽抗原：c100p（5-1-1p），c22p,RIBA HCV 3.0,c100-3,NS5,c33c,c22-3,SOD,3+ Control,1+ Control,Pos,IND,Pos,Neg,IND,RIBA模式图,3 + control band (serum addition),Capsid,NS3-1,NS3-2,NS4,NS5,1+ control band (reagent addition),GLD
9、 HCV BLOT 3.0,（第四类） 蛋白芯片（微阵列）类试剂,蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（蛋白芯片法）； 多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）,（第五类） 单抗类试剂,血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单克隆抗体） 免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒（单抗） 免疫比浊：血清载脂蛋白A1免疫比浊试剂盒 乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂盒,（第六类） 多抗类试剂,血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人血清/马血清） 免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗） 免疫比浊：-微球蛋白测定试剂盒（免疫比浊法） 乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒,抗原,抗原：指进入有免疫活性的组
10、织（宿主）而引发免疫应答的物质。或虽不能引发免疫，但可以同抗体结合的物质。蛋白质，多糖，核酸，糖脂，青霉素 全抗原性具有多个抗原决定族,抗体,宿主对体内存在的外来分子，微生物或其他因子的应答而产生的蛋白质（免疫球蛋白，丙种球蛋白） 根据抗体性质：多克隆抗体，单克隆抗体 根据抗体分子结构：IgA, D, E, G, M,IgG,IgM,抗体模式图,单克隆抗体,由一株淋巴细胞产生，针对一种抗原决定族 抗原免疫小鼠-取脾脏-与瘤细胞融合-克隆筛选-单克隆抗体细胞株 扩增细胞-注射入小鼠腹腔-采腹水-纯化抗体,流 程,杂交瘤技术,多克隆抗体,针对多个抗原决定族 抗原免疫动物-采集动物血清 纯化抗体,血
11、型 抗原/RBC 抗体/外周血A A anti-BB B anti-AO none anti-A & anti-BAB A & B none,ABO血型测定,空气柱,微 柱,玻璃珠,反应舱,试剂,结果判读,（第七类） 诊断血清（菌液）,诊断血清：侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清； 志贺氏菌属四种混合多价血清 诊断菌液：伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原诊断菌液,诊断血清工艺流程,采集血清,收集抗体（离心机）,效价检测等,分装、冻干,免疫动物,免疫抗原制备,分离血清,灭活处理,吸收非特异性抗体,吸收用抗原制备,诊断菌液工艺流程,效价检测等,分装、包装,细菌培养,灭活处理,（第八类） 血球凝集类试
12、剂,抗体致敏血球：破伤风抗体诊断试剂（血凝法）； 白喉抗体诊断试剂（血凝法）,间接凝集试验示意图,+,用可溶性抗原致敏红细胞或其它颗粒性介质，可以用来测定细菌、病毒等微生物的抗体。,间接血凝试剂基本生产工艺流程,醛化红细胞的制备,致敏抗原或抗体的制备,红细胞的采集,致敏抗原（或抗体）的制备,红细胞的醛化 （洗涤、离心、醛化）,致敏抗原（或抗体）的检定,对照血球的制备,红细胞的致敏 （鞣化、致敏、封闭）,稀释液的制备,半成品检定,分装、冻干、包装,成品检定,（第九类） 核酸扩增类试剂,荧光PCR：乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒 PCR-ELISA：结核分支杆菌检测试剂盒（核酸扩增酶联免疫法） P
13、CR-毛细管电泳：性染色体多倍体（分型与突变）检测试剂盒； PCR-电泳：-地中海贫血基因诊断试剂盒（gap-PCR法） 转录介导扩增（TMA）：沙眼衣原体与结核分枝杆菌检测试剂盒,PCR基本原理示意图,PCR,过氧化物酶联物,96孔酶标法,加样,分析,观察 数据,PCR产物的检测 96孔酶标法,Taqman法的原理,Polymerization,5,5,3,3,5,Forward Primer,5,Reverse Primer,Strand Displacement,5,5,3,3,5,5,P 3,R,Q,R,Q,Probe,P 3,R,Q,Cleavage,5,5,3,3,5,5,P 3,
14、R,Q,Polymerization Completed,5,5,3,3,5,5,P 3,R,Q,Reporter,Quencher,Chiron Procleix HIV-1/HCV Assay Step 2: Transcription-Mediated Amplification,Isothermal incubation109 fold amplification in one hour,（第十类） 基因芯片（微阵列）类试剂,基因芯片（微阵列）：-地中海贫血基因芯片诊断试剂盒 PCR-杂交：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向杂交法）,基因芯片法联合检测HBV DNAHCV R
15、NA,乙型肝炎病毒基因多态性检测芯片芯片外观及点样区示意图如上： 点阵信息：点阵信息： A1: 1896野生型 B1: 1896 突变型 A2: 1814野生型 B2: 1814 突变型 A3: 1762野生型 B3: 1762 突变型 A4: 1764野生型 B4: 1764 突变型 A5: P区528位 野生型 B5: P区528位突变型 A6: P区552位 野生型 B6: P区552位 突变型 A7: P区552位 突变型 B7： 阴性参照,检 测 结 果 图 1762/64位点联合变异,丙型肝炎病毒基因分型检测 芯片示意图,：阳性内参照I； ：阴性内参照I； ：阳性内参照II； ：阴
16、性内参照II。A1: I型 B1: I型 A2: 1a/2a B2: 1a/1b A3: 1b B3: 1 b A4: II型 B4: II型 A5: 2a B5: 2a A6: 3a/3b B6: 3b A7: 3b B7: 6a A8： 阴性 A8：阴性,丙型肝炎病毒基因分型芯片示意图,（第十一类） 探针放大（原位杂交）类试剂,bDNA类：HIV-1 bDNA 检测试剂盒； mRNA检测试剂盒(生物素原位杂交法),探针放大类试剂-支链DNA技术,病毒的RNA释放后加入微孔板中板孔中包被有可与病毒特异结合的一系列靶探针（Target Probe），另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链
17、上，另一端可与bDNA结合bDNA信号放大加入酶标记物对结合的bDNA进行标记经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度。,（第十二类） 普通生化类试剂（十万级要求）（包括酶类化学试剂、凝血试剂类等试剂）,酶类化学试剂:丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒； 碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒 凝血试剂:凝血酶原时间（PT）测定试剂盒； 组织纤溶酶原激活物（t-PT）测定试剂盒,普通生化类试剂(十万级要求)（1）,原理：临床普通生化类试剂是一类用于测定人血液、尿液等中各项生化指标的试剂。含有各种非特异性蛋白成分，要求在十万级洁净环境中生产。检测方法均为比色法，方法学原理均为显色反应。产品涉及：1、酶
18、类：含酶、辅酶与牛血清白蛋白等、剂型为干粉或液体。2、血凝类：试剂组分中含有其他活性类组分（如兔脑粉等）。 生产工艺：原材料称量、溶解、定容、中试、分装、组装、成品检验。 关键控制点：原料称量、配制、物料平衡。细则要求：应在10万级净化环境中进行生产操作。,（第十三类） 普通生化类试剂（清洁环境）（包括一般化学试剂、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等）,一般化学试剂：无机离子（铝、镉等）测定试剂盒； 白蛋白测定试剂盒（BCG法）； 总胆固醇测定试剂盒（COD-CE-PAP法） 血气电解质:电解质分析仪随机试剂；生化分析仪用稀释液、冲洗液 血液分析仪用试剂: 血液分析仪用稀释液、溶血剂,普通生化
19、类试剂（清洁环境）,原理：与普通生化试剂（十万级要求）类相同。产品涉及：无机离子检测、血气电解质类、血液分析仪用试剂类等试剂。 工艺要求：除生产可在清洁环境中进行操作外，生产工艺和关键控制点与普通生化试剂（十万级要求）类相同。,（第十四类） 干化学类试剂,干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条； 尿微量白蛋白（UALB）测试卡,干化学类试剂,原理：以滤纸为载体，将各种试剂组分浸渍后干燥，作为试剂层，固定在支持物上，试纸上的各测试块与被测样品中的成分发生酶化学反应，使试纸块发生不同的颜色变化，颜色深浅与样品中的成份含量成正比，再由光电耦合元件对测试块的颜色进行判读，达到测定样品中化学成分
20、含量的目的。 生产工艺主要环节：特定试剂的配制、试剂条的浸润、干燥、切割、分包装等；,（第十五类） 药敏类试剂,药敏纸片（卡）：抗生素药敏纸片；随机专用药敏试剂（盒）（卡）,药敏类试剂,原理：是将抗菌药物吸收到特定的纸片中，然后置于已接种待测定菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的生长，从而出现抑菌环（带）。由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，故可以根据抑菌环的大小，判断细菌对药物的敏感度。通过药物敏感试验，我们可以找出针对于某些致病菌的敏感药物，从而对临床中的细菌性疾病的治疗提供指导。 工艺：配抗生素溶液浸泡 干燥（冻干或烘干） 分包装纸 打 孔药敏纸片
21、的关键工艺是纸片的浸泡，它直接影响产品质量。,（第十六类） 培养基类,马丁干粉培养基；人胚胎干细胞无血清培养基,培养基,培养基（Medium）是供微生物、植物和动物组织生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等。有的培养基还含有抗菌素和色素。 按所用原料不同，可分为天然培养基（如肉汤）和合成或综合培养基（应用化学药品配成）。 培养基由于配制的原料不同，使用要求不同，而贮存保管方面也稍有不同。 一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此一般培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。对一些需严格灭菌的培养基（如组织培养基），较长时间的贮存，必须放在26的冰箱内。 厂房要求：普通洁净间，有除湿、去粉尘设施。,总结,体外诊断试剂种类 各类诊断试剂的基本原理 国家参考品及研制过程 抓住要点：首先了解试剂基本原理，抓住关键工艺及质控要点，总体把握该产品是否可保质量稳定生产,谢谢,
