1、论著 文章编号 :100025404(2005) 1221232204诺帝抑制糖尿病大鼠视网膜 VEGF 和 iNOS 的表达及意义戴 超 ,卞修武 , 史景泉 (第三军医大学西南医院病理科 ,重庆 400038)提 要 : 目的 检测诺帝对实验性糖尿病大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor , VEGF)和诱导型一氧化氮合酶 (inducible nitric oxide synthase , iNOS)表达的影响 ,探讨诺帝抑制糖尿病视网膜病变的可能机制。 方法 采用链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病模型 ,将动物随机分为糖尿病组 (5
2、 只 2) 、诺帝治疗组 (5 只 2) ,另取 10 只正常大鼠作为正常对照组 ,其中 ,诺帝治疗组在出现糖尿病表现后按 27 mgPkg 腹腔注射诺帝溶液 (隔日 1 次 ) ,糖尿病组和正常对照组只在同期注射等量生理盐水。注射后 1、 3 个月取视网膜制备切片 ,采用免疫组织化学方法半定量检测视网膜中VEGF和 iNOS阳性反应及其分布。 结果 正常对照组大鼠视网膜 VEGF 和 iNOS 呈极微弱的表达。 1 个月时 ,糖尿病组VEGF和 iNOS阳性反应增强 ,其阳性反应面积较正常对照组显著增加 ( P 0. 01) ;诺帝治疗组大鼠视网膜 VEGF和 iNOS阳性表达面积较糖尿病组
3、明显减少 ( P 0. 01) 。在 3 个月时 ,糖尿病组 VEGF和 iNOS阳性表达较 1 个月明显增加 ;诺帝治疗组较糖尿病组 VEGF和 iNOS表达明显减少 ,阳性表达面积在两组间有非常显著的差异 ( P 0. 01) 。 结论 诺帝明显抑制实验性糖尿病大鼠视网膜 VEGF和 iNOS阳性反应 ,提示诺帝可能通过降低糖尿病大鼠视网膜 VEGF 和 iNOS的产生 ,从而缓解大鼠糖尿病视网膜病变。关键词 : 糖尿病视网膜病变 ;血管内皮细胞生长因子 ;一氧化氮合酶 ;诺帝中图法分类号 : R322. 91 ; R587. 202 ; R914. 3 文献标识码 : ANordy in
4、hibits the expression of vascular endothelial growth factor and inducible nitricoxide synthase in diabetic rat retinasDAI Chao , BIAN Xiu2wu , SHI Jing2quan (Department of Pathology , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing400038 ,China)Abstract : Objective To observe the
5、effects and significance of Nordy on the expression of vascular endothelialgrowth factor (VEGF) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the retinas of diabetic rats. Methods Diabeticrats by streptozotocin were randomly divided into diabetes group (5 rats 2) and Nordy treatment group (5 rats 2)
6、 .Another 10 normal rats were recruited as normal control group. The Nordy treatment group was injected 0. 5 % Nordy(27 mgPkg) while diabetes groups and normal control group were injected saline solution into peritoneal cavity onceevery other day. One month or 3 months later , 5 rats in each group w
7、ere killed and the expression of VEGF and iNOSin the retinas were detected by immunohisochemistry. The average positive areas were measured and analyzed by com2puter aided video system. Re sults The expression of VEGF and iNOS in control group were extremely low. In 1month , the expression of VEGF a
8、nd iNOS in diabetic group increased and the average positive areas of VEGF and iN2OS were significantly more than that of Nordy treatment group ( P 0. 01) . In 3 months , the expression of VEGF andiNOS in diabetic group further increased and the average positive areas of VEGF and iNOS were remarkabl
9、y more thanthat of Nordy treatment group ( P 0. 01) . Conclusion Nordy injected intraperitoneally decreases the expression ofVEGF and iNOS in retinas of diabetic rats so that Nordy partly suppresses the development of diabetic retinopathy.Key words : diabetic retinopathy ; vascular endothelial growt
10、h factor ; inducible nitric oxide synthase ; Nordy基金项目 :国家高技术研究发展计划资助项目 (“ 863”计划 ) (2002AA001010)Supported by the National“ 863” High2Tech Development Plan of China(2002AA001010)作者简介 :戴 超 (1967 - ) ,男 ,四川省泸州市人 ,博士研究生 ,主治医师 ,主要从事糖尿病视网膜病变方面的研究。电话 : (023) 68765459通讯作者 :卞修武 ,电话 : (023) 68752247 ,E2mail
11、 : bianxiuwu 263. net收稿日期 :2005203209 ;修回日期 :2005205215有研究表明 ,在糖尿病时以血管内皮细胞生长因子 (vascular endothelial growth factor , VEGF) 为主的促血管生长因子在视网膜过表达促进了糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy , DR) 的形成以及新生血管生成 1 , 2 ,降低 VEGF 的表达和阻断 VEGF 与其受体结合能明显抑制 DR 的形成和发展 3 , 4 。我们既往研究证实 ,去甲二氢愈创木酸 (nordihydroguaiaretic acid ,NDGA)2
12、321第 27 卷第 12 期2005 年 6 月 第 三 军 医 大 学 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 27 , No. 12Jun. 2005具有抑制胶质瘤细胞产生 VEGF 的效应 5 。本研究旨在观察我们自行合成的 NDGA 类化合物诺帝 (Nordy)对实验性糖尿病大鼠视网膜表达 VEGF 的影响以及诺帝能否抑制 iNOS 的产生 ,并探讨其可能意义及其机制。1 材料与方法1. 1 动物模型实验用封闭群雄性 Sprague Dawley (SD)大鼠 ,体质量 180200 g ,由第三军医大学大坪医院野战外科研
13、究所实验动物中心提供 ,标准条件饲养 ,不限饮食。链脲佐菌素 ( streptozotocin ,STZ ,购自 Sigma 公司 ) ,以 011 molPL 柠檬酸盐缓冲液 (柠檬酸 2柠檬酸三钠 ,pH 4. 2)配制成 1 % STZ溶液 ,按 60 mgPkg 腹腔注射 ,注射后次日起用 SureStepTMPlus血糖仪 (美国 Lifescan 公司 ) 每 2周检查鼠尾血糖 ,以血糖 17 mmolPL 者视为糖尿病大鼠 ,取材前重复测血糖 1 次。1. 2 动物分组、组织取材和制片将糖尿病大鼠随机分为诺帝治疗组 (10 只 ) 和糖尿病组 (10只 ) ,另取 10 只正常大
14、鼠作为正常对照组。诺帝组以 0. 9 %生理盐水溶解的诺帝按 27 mgPkg 腹腔注射 ,隔日 1 次 ,糖尿病组和正常对照组腹腔注射等量生理盐水。各组大鼠分别于注射后 1 个月、 3 个月用 2 %戊巴比妥钠过量麻醉取材 ,经 10 %中性缓冲甲醛固定 ,常规石蜡包埋、制片。1. 3 各组大鼠视网膜 VEGF 和 iNOS表达的检测采用免疫组织化学 EnVision 法 ,鼠抗人 VEGF 单克隆抗体购自美国 Sigma 公司 ,兔抗人 iNOS 多克隆抗体购自美国 SandaCruz 生物公司 ,EnVision + TMSysterm检测及显色试剂盒购自 DA2KO公司 ,按说明书进行
15、操作。主要步骤为 :切片脱蜡、水化 ;3 %过氧化氢 2甲醇封闭内源性过氧化物酶 ,15 min ;0. 01 molPL枸橼酸盐缓冲液 (pH 6. 0)微波热修复 ,15 min ;正常山羊血清封闭 ,20 min ;滴加 VEGF一抗 (1 100)或 iNOS一抗 (1 100) ,4 过夜 ;抗兔 P或鼠 EnVision2辣根过氧化物酶复合物 ,40 min ;以上各步骤间均以 0. 01 molPL PBS 缓冲液充分漂洗 ,DAB 显色 ,苏木精复染 ,常规梯度乙醇脱水 ,二甲苯透明 ,中性树胶封固。每次检测均以抗体稀释液代替一抗设为阴性对照 ,结果判定 :以视网膜细胞胞浆内出
16、现明确棕黄色为阳性反应。1. 4 计算机图像采集及分析各组各时相点分别取 3 张切片 ,每张切片在光镜 200 放大条件下随机采集阳性染色最强的 5 个视野 (即每只动物 15帧测试图像 ) ,输入计算机后应用 Image2Pro Plus 图像分析系统测定视网膜 VEGF和 iNOS阳性着色的平均面积。1. 5 统计学处理计算机图像处理数据以 x s 表示 ,采用 SPSS 10. 0 统计学软件进行单因素方差分析。2 结果2. 1 各组大鼠视网膜 VEGF 表达的变化光镜观察 :在处理 1 个月时正常对照组仅见 1 只大鼠视网膜视细胞内节呈极微弱的 VEGF 细颗粒状阳性着色 ;而糖尿病组
17、大鼠视网膜均可见 VEGF 表达 ,主要位于视细胞全层及视网膜色素上皮层 ,呈弱阳性 ;诺帝处理组仅有 2 只大鼠视网膜视细胞内节可检测到较弱的 VEGF 阳性棕黄色反应 ,另外 3 只则未检测到 VEGF表达信号。在 3 个月时 :糖尿病组大鼠视网膜VEGF表达增强 ,阳性信号贯穿于视网膜全层 ,尤以视细胞层及色素上皮层表现最为显著 ,呈深棕色强阳性反应 ;诺帝处理组所有大鼠的视网膜均可见 VEGF 表达 ,主要在视细胞内节区呈中等强度的阳性着色 ,但阳性反应程度及表达区域较同时期糖尿病组显著减少 (图 1) 。A : Normal control group (3 months) ; B
18、: Diabetes group (3 months) ; C: Nordy treatment group (3 months)图 1 各组大鼠视网膜 VEGF的表达 ( EnVision 200)Fig 1 VEGF expression in the rat retinas of different groups ( EnVision 200)2. 2 各组大鼠视网膜 iNOS表达的变化光镜观察 :在处理后 1、 3 个月两时相点 ,正常对照组仅有 1 2 只大鼠视网膜可见极微弱的 iNOS细颗粒状表达 ,其余大鼠的视网膜均未检测到 iNOS阳性信号 ;糖尿病组大鼠 iNOS主要表达于视
19、网膜的内核层及内界膜 ,呈较强阳性反应 ,在 3 个月时 ,iNOS阳性表达显著增强 ,呈弥漫的深棕色强阳性反应 ,在视细胞层和外核层也可见颗粒状阳性着色 ;诺帝处理组所有大鼠在处理后 1 个月时可见 iNOS 阳性反应信号散在分布于视网膜 ,呈细颗粒状 ,反应较弱 ;后期 iNOS 阳性表达较 1 个月时有所增强 ,但与同期糖尿病 3 个月组相比 ,iNOS 阳性表达的程度和反应区域显著减少 ,阳性着色降低的部位也主要发生在内界膜和外核层之间 (图 2) 。3321第 12 期 戴 超 ,等 . 诺帝抑制糖尿病大鼠视网膜 VEGF和 iNOS的表达及意义 A : Normal control
20、 group (3 months) ; B : Diabetes group (3 months) ; C: Nordy treatment group (3 months)图 2 各组大鼠视网膜 iNOS 的表达 ( EnVision 200)Fig 2 iNOS expression in the rat retinas of different groups ( EnVision 200)2. 3 计算机图像定量分析结果见表 1、 2 ,在处理后 1 个月和 3 个月两时相点 ,糖尿病组大鼠视网膜 VEGF、 iNOS的阳性反应面积均远远高于同时期正常对照组和诺帝治疗组的相应阳性面积 ,
21、差异具有非常显著性统计学意义 ( P 0. 01) ,而处理后期 (3 个月时 ) 糖尿病组大鼠视网膜 VEGF和 iNOS的阳性反应面积均较处理早期 (1 个月时 )明显增加 ( P 0. 01) ;诺帝处理后大鼠视网膜 VEGF 和 iNOS 的表达较糖尿病大鼠者显著降低 ,且随着处理时间的延长 ,同组大鼠视网膜 VEGF、 iNOS的阳性反应面积均有极为明显的下降( P 0. 01) 。表 1 大鼠视网膜 VEGF阳性染色平均面积 ( m2 , n = 5 , x s)Tab 1 Average area of positive expression of VEGF inrat reti
22、nas ( m2 , n = 5 , x s)Group 1 month 3 monthsControl 3. 6637 0. 6109 # 3. 6320 0. 0. 5080 #Diabetes 11. 7595 0. 5079 22. 7456 0. 2245Nordy treatment 3. 8217 0. 5802 3# 9. 5986 0. 2308 #3 : P 0. 05 , vs control group ; # : P 0. 01 , vs diabetes group表 2 大鼠视网膜 iNOS 阳性染色平均面积 ( m2 , n = 5 , x s)Tab 2 Av
23、erage area of positive expression of iNOS inrat retinas ( m2 , n = 5 , x s)Group 1 month 3 monthsControl 1. 4919 0. 2475 # 1. 4323 0. 2395 #Diabetes 6. 9175 1. 0402 13. 1789 1. 6763Nordy treatment 2. 6244 0. 7871 # 5. 7278 0. 1275 # : P 0. 01 , vs diabetes group3 讨论注射 STZ诱发大鼠糖尿病是目前研究 DR 病理改变、发病机制和药物
24、治疗性干预的最常用动物模型之一。该动物模型能复制出人类 DR 的绝大多数病理改变。人和动物糖尿病时视网膜血管通透性增加和血液流变学改变是 DR 的早期和主要病变。 VEGF 作为一种强烈的血管通透性因子和血管内皮细胞有丝分裂原 ,在DR 的发生发展过程中起着至关重要的作用 1 ,2 。另外 ,在糖尿病人和动物的视网膜均能检测到 iNOS过表达 ,且在出现临床 DR 前 ,iNOS 促进早期的视网膜氧合功能不全 6 。 iNOS 在视网膜的过表达可引起视网膜血液流变学改变、毛细血管通透性增加、血 2视网膜屏障损害、视网膜神经元细胞凋亡等 ;促进 DR 的形成。降低 iNOS的产生对 DR 具有抑
25、制作用 7 。糖尿病时视网膜过表达 VEGF 和 iNOS ,二者能相互作用使它们的效应不断放大 ,促进 DR 的形成和进展。本研究表明 ,STZ诱导的糖尿病大鼠在早期 (1 个月 )即可出现 VEGF 在视网膜的过表达 ,随着病程的延长 ,VEGF 过表达增强 ,在糖尿病 3 个月时 ,VEGF 阳性表达弥漫于全视网膜 ,表明 VEGF 参与了 STZ 诱导的大鼠 DR 的演进。研究表明 8 ,糖尿病时抑制 VEGF 在视网膜的产生可有效地降低其渗出 ,缓解 DR。我们采用我室合成诺帝按 27 mgPkg 腹腔注射 ,可明显地降低VEGF在糖尿病大鼠视网膜的过表达 ,提示诺帝能降低糖尿病大鼠
26、视网膜 VEGF 合成增加 ,进而可能在降低视网膜通透性、抑制血管内皮增生等方面具有一定的作用 ,从而缓解 DR。另外 ,视网膜色素上皮和视细胞层的血供来源于脉络膜 ,且代谢活跃 ,对缺氧十分敏感。我们发现 STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜 VEGF 过表达主要集中在这些部位 ,而诺帝处理可明显地抑制VEGF 在上述部位的过表达。本研究结果显示 ,在 STZ诱导的糖尿病大鼠 1 个月时 iNOS 在视网膜的表达增强 ,到 3 个月时 ,iNOS在视网膜的表达进一步增加 ,提示 iNOS 在视网膜的过表达与糖尿病的病程有关 ,Takeda 等 9 的研究也证明了这一结论。我们采用诺帝27 mgPkg
27、 腹腔注射 ,可明显地降低 iNOS 在糖尿病大鼠视网膜的表达 ,提示诺帝能通过抑制 iNOS的产生对糖尿病大鼠视网膜起保护作用。总之 ,应用诺帝处理可降低 VEGF 和 iNOS在糖尿病大鼠视网膜的过表达 ,破坏 VEGF 和 iNOS相互促进形成的恶性循环 ,从而可能抑制糖尿病所致的视网膜血液流变学改变和维持血 2视网膜屏障的稳定以维持视网膜形态和功能的稳定。4321 第 三 军 医 大 学 学 报 第 27 卷诺帝是我室合成的特异性脂氧化酶抑制剂 ,作为一种强力的抗氧化剂 ,能抑制胶质瘤细胞表达 VEGF及其受体 KDR5 。而抗氧化治疗也是糖尿病视网膜病变的治疗措施之一 10 ,我们将
28、诺帝用于 DR 的治疗发现 ,诺帝可在一定程度上缓解 DR。我们认为这种抑制效应可能主要与诺帝的抗氧化作用有关。参考文献 :1 Takagi H , Oh H , Otani A , et al. Molecular mechanisms of retinal neovas2cularization in diabetic retinopathy J . International Congress Series ,2004 ,1262 : 160 - 163.2 Cukiernik M , Hileeto D , Evans T , et al. Vascular endothelial g
29、rowth fac2tor in diabetes induced early retinal abnormalities J . Diabetes Res ClinPrac ,2004 ,65 (3) : 197 - 208.3 Scaria A , Pechan P , Lukason M , et al. Inhibition of retinal neovascular2ization by intraocular gene delivery of soluble VEGF receptors J . MolTher , 2004 ,9 (Suppl 1) :S198.4 Marano
30、 R J , Wimmer N , Kearns P S , et al . Inhibition of in vitro VEGFexpression and choroidal neovascularization by synthetic dendrimer peptidemediated delivery of a sense oligonucleotide J . Exp Eye Res , 2004 ,79(4) : 525 - 535.5 孙慧勤 , 陈意生 , 史景泉 , 等 . 去甲二氢愈创木酸对 VEGF 及其受体 KDR 基因表达影响的研究 J . 第三军医大学学报 ,
31、2001 ,23(3) : 268 - 271.6 Berkowitz B A , Luan H , Gupta R R , et al. Regulation of the early sub2normal retinal oxygenation response in experimental diabetes by induciblenitric oxide synthaseJ . Diabetes , 2004 ,53 (1) : 173 - 178.7 Cukiernik M , Hileeto D , Downey D , et al. The role of the sodium
32、 hydro2gen exchanger21 in mediating diabetes2induced changes in the retina J .Diabetes Metab Res Rev , 2004 ,20(1) : 61 - 71.8 Ayalasomayajula S P , Kompella U B. Celecoxib , a selective cyclooxygenase- 2 inhibitor , inhibits retinal vascular endothelial growth factor expressionand vascular leakage
33、in a streptozotocin - induced diabetic rat model J .Eur J Pharmcol , 2003 ,458 (3) : 283 - 289.9 Takeda M , Mori F , Yoshida A , et al. Constitutive nitric oxide synthase isassociated with retinal vascular permeability in early diabetic ratsJ . Dia 2betologia , 2001 ,44 (8) : 1043 - 1050.10 Rota R ,
34、 Chiavaroli C , Garay R P , et al. Reduction of retinal albuminleakage by the antioxidant calcium dobesilate in streptozotocin - diabeticrats J . Eur J Pharmacol , 2004 , 495 (2) : 217 - 224.(编辑 龙 亮 )文章编号 :100025404(2005) 1221235201 个案与短篇内镜下经鼻眶减压术对鼻通气功能的影响Effect of endoscopic transnasal orbital deco
35、mpression on nasal air way张龙城 ,钟海林 ,林文彪 ,蒋 静 (解放军第 303 医院耳鼻咽喉科 ,南宁 530021)内镜下经鼻眶减压手术治疗眼球突出 ,可取得良好的效果 1 ,但该手术对鼻通气功能有无影响 ,国内外少见报道。冷镜法是一种用于研究鼻呼吸生理和评价鼻腔手术效益的客观方法 2 。为探讨该手术对鼻通气功能的影响 ,我们对 16 例甲状腺机能障碍性眶病患者手术前后鼻通气情况应用冷镜法进行测试 ,报告如下。1 材料与方法1. 1 测试对象对照组 :16 例 ,男女各 8 例 ,平均 29 岁 ,均无鼻病史 ,近 1个月内无上呼吸道感染病史 ,鼻部检查无解剖异
36、常。手术组 :我院耳鼻咽喉科行内镜下鼻眶减压术治疗的 16例 (32 眼 )甲状腺机能障碍性眶病患者 ,男 7 例 (14 眼 ) ,女 9 例(18 眼 ) ,平均 31 岁。作者简介 :张龙城 (1964 - ) ,男 ,湖北省武穴市人 ,主任医师 ,主要从事耳鼻咽喉 2头颈外科临床方面的研究 ,发表论文 10 篇。电话 : (0771)2870160收稿日期 :2004211222 ;修回日期 :20052042041. 2 测试方法取一块面积 30 cm 20 cm、厚 3 mm、表面镀铬的不锈钢板 ,以一侧长边为基底线 ,以此线中点为中心 ,在板面上各距 1 cm刻画出半圆形弧线并标
37、上相应数字。受检者处于室温 20 30 ,湿度 45 % 55 %的环境中 ,静坐 10 min 后 ,将冷镜板水平置于受检者鼻孔下方 ,使基底线中点和鼻小柱接触 ,嘱受检者闭嘴 ,用鼻平静呼吸 5 次 ,冷镜板上明显出现呼出蒸气的冷凝图影 ,立即用色笔在板面上勾画出其轮廓 ,用分规测出影长 a 线 ,并从 a 线中点测量出影宽 b 线 ,按公式 S = a b 4 算出影面积的近似值 2 。受检者休息 10min 后再测 1 次 S值 ,取前后两次平均数为测量值。手术组患者分别于术前、术后 3 个月和术后 1 年作冷镜法检测。1. 3 统计学处理所有数据采用 SPSS for Windows Version 8. 0进行配对 t 检验。2 结果术后 3 个月内鼻 2鼻窦粘膜均有一定程度水肿、囊泡形成和增生 ,术腔内有干痂形成及粘性分泌物附着 ,患者有鼻塞感。(下转 1239 页 )5321第 27 卷第 12 期2005 年 6 月 第 三 军 医 大 学 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE Vol. 27 , No. 12Jun. 2005
