1、纤维二糖水解酶的研究进展 袁茂翼 叶发银 雷琳 赵国华 西南大学食品科学学院 重庆市特色食品工程技术研究中心 摘 要： 纤维素是世界上最丰富的可再生资源, 将其降解为小分子糖并转化为燃料或精细化学品一直是研究的难点和热点。纤维二糖水解酶是生物降解纤维素的关键酶之一, 它属于外切酶, 作用于结晶纤维素的链末端依次切开相隔的 -1, 4-糖苷键, 释放纤维二糖。论文对纤维二糖水解酶的来源、分类、结构, 对纤维素的作用机理、酶学性质、分子进化、商业酶制剂生产情况及其应用特性进行了总结, 同时对该研究进行了展望。关键词： 纤维二糖水解酶; 酶学性质; 结构; 催化机理; 应用; 作者简介：袁茂翼, 硕
2、士研究生作者简介：赵国华, 教授, E-mail:zha-。收稿日期：2017-05-17基金：果蔬典型加工过程中品质功能劣变与保质减损及其调控机理 (2016YFD0400204-2) Research progress of cellobiohydrolasesYUAN Mao-yi YE Fa-yin LEI Lin ZHAO Guo-hua College of Food Science, Southwest University; Abstract： Cellulose is the richest renewable resource in the world, and it ha
3、s been a difficult and hot spot for research to break down into small molecular sugars and turn them into fuel or fine chemicals.Cellobiohydrolase is one of the key enzymes of cellulose biodegradation, which belongs to excision enzyme.It acts on the end of the chain of crystalline cellulose and cuts
4、 the separated beta-1, 4-glycosidic bond, finally releasing cellobiose.In this article, the source, classification, structure, the action mechanism, enzymatic properties of cellobiohydrolases, molecular evolution, production situation of commercial enzymes and their application characteristics are s
5、ummarized.In addition, the research perspective on cellobiohydrolasesis proposed.Keyword： cellobiohydrolase; enzymatic properties; structure; catalytic mechanism; application; Received： 2017-05-17纤维素酶是能将纤维素水解的酶的统称, 是一类复杂的多酶体系, 主要包括内切葡聚糖酶 (EC3.2.1.4) 、外切葡聚糖酶 (EC3.2.1.91 和 EC3.2.1.176) 和-葡萄糖苷酶 (EC3.2.
6、1.21) , 它们协同作用于纤维素使其彻底降解为葡萄糖。其中, 内切葡聚糖酶主要作用于纤维素的非结晶区, 将纤维素长链降解为小分子纤维素或寡糖链;外切葡聚糖酶又称作纤维二糖水解酶 (cellobiohydrolase, CBH) , 与内切葡聚糖酶协同作用并负责降解纤维素的结晶区, 将纤维素链剥离并水解 -1, 4-糖苷键释放纤维二糖1。-葡萄糖苷酶不直接作用于纤维素, 主要是将内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶作用产生的寡糖链和纤维二糖水解为葡萄糖。鉴于 CBH 在食品物料改性以及生物质能源生产上巨大的应用潜能, 本文在主要查阅国内外近 10 年文献的基础上, 对 CBH 生物来源、理化特征及潜在
7、应用进行了综述, 并对 CBH 研究中存在的问题和今后的研究方向进行了探讨, 以期推动 CBH 的深入研究及产业化应用。1 纤维二糖水解酶的分类及来源目前, 对 CBH 的命名法主要包括 EC 法、CAZy 法和 myco CLAP 法等。在酶的国际系统分类编号 (EC) 中, 纤维二糖水解酶占两个编号:EC3.2.1.91 (GH5、GH 6、GH 9) 和 EC 3.2.1.176 (GH7、GH 9、GH 48) , 其中 CBH (EC 3.2.1.176) 作用于纤维素链的还原端, CBH (EC 3.2.1.91) 作用于纤维素链的非还原端2-3。真菌是纤维二糖水解酶的主要来源,
8、主要是木霉、青霉和曲霉, 且菌株多为野生型;另外也有产生 CBH 的细菌, 但其产量比较低, 因此相关研究不多 (表 1) 。表 1 纤维二糖水解酶的来源 Table 1 The source of cellobiohydrolasees 下载原表 CAZy 数据库 (http:/www.cazy.org/) 是专门针对碳水化合物活性酶的基因组、结构和生物化学信息的开放获取网络。CAZy 数据库根据酶催化结构域氨基酸序列的相似性4-5, 将已报道的糖苷水解酶划归为 144 个家族, 其中真菌 CBH 归属到 GH6 和 GH7 两个糖苷水解酶家族, 对于细菌来源的 CBH 属于GH48、GH9
9、、GH6、GH5。此外, myco CLAP 数据库 (http:/mycoclap.fungalgenomics.ca) 提供木质纤维素相关酶和活性蛋白质的信息, 该数据库提供的命名法能直接反映出酶的功能、所属糖苷水解酶家族以及来源微生物的种属信息。如名称为 CBH6A_COPCI 的酶指来自 Coprinopsis cinerea, 属于 GH6 家族的纤维二糖水解酶。2 纤维二糖水解酶的结构里氏木霉 (Trichoderma reesei) CBH 是真菌 CBH 的典型代表, 对其结构的研究也最为完善。研究 CBH 结构发现包含了具有降解活性的催化结构域 (catalytic doma
10、in, CD) 和吸附纤维素的纤维素结合结构域 (cellulose binding domain, CBD) , 这两个结构域由一段 O-糖肽链的连接桥 (linker) 相连接。里氏木霉 CBH 的 CBD 为“楔型”结构, 一面亲水, 另一面疏水, 且亲水面上的 3 个酪氨酸残基组成纤维素的吸附位点6。这些结构域位于肽链的羧基端 (C-端) 或氨基端 (N-端) 。在此基础上也有人研究其他菌, 比如来自Neocallimastix patriciarum J11 的 CBH 的 CBD 位于 N-端, 包含Asn、Ala、Gly 和 Gla 等残基, 而 CD 位于 C-端, 其连接桥包
11、含 Asn (28.8%) 、Ala (13%) 、Gly (13.7%) 和 Gla (10.1%) 7。CBH 的糖基化包括 CD 的 N-糖基化和连接桥的 O-糖基化, 前者发生在天冬酰胺残基上, 后者发生在丝氨酸和苏氨酸残基上8。有报道认为高度糖基化会降低重组里氏木霉 CBH对结晶纤维素的水解活性9。2.1 催化结构域 (CD) 里氏木霉 CBH的 CD 的结构在 1994 年被解析, 为反平行 -折叠形成的三明治主体结构, 包含有 4 个短 -螺旋和 -束形成的线圈结构, 并有 10 个二硫键10, CBH通道至少有 10 个结合位点 (-7 到+3) 11, 4 个色氨酸残基 (T
12、rp) 促进纤维素糖单元的疏水堆积相互作用, 这 4 个 Trp 分别是进口处的 Trp-40, 中心处的 Trp-38, 围绕催化位点的 Trp-367 和 Trp-37612。催化活性位点的3 个氨基酸在催化机制中起着关键作用, Glu-217 是催化酸和催化基础, Glu-212 是形成酶-糖基中间产物的亲核试剂, Asp-214 通过侧链氢键与亲核试剂形成稳态相互作用11。研究 Phanerochaete chrysosporium 的 Cel7A 发现, N端氨基酸谷氨酰胺循环产生焦谷氨酸残基, 有 Asn188 和 Asn286 两个潜在的糖基化位点。Asn 286 结合 N-乙酰
13、氨基葡萄糖4。2.2 纤维素结合结构域 (CBD) 目前已确定约有 130 个不同的 CBD 的结构。根据其氨基酸序列的相似性划分为13 个不同的 CBD 家族。同一家族中的 CBD 的结构相似, 而不同家族的 CBD 结构具有拓扑性。真菌 CBH 的 CBD 大约由 35 个氨基酸残基构成13。脱离了母体CBH 的 CBD 没有催化活性, 不能水解纤维素。王禄山等14提出 CBD 在 CBH降解纤维素过程中担负两个角色:1) 通过其吸附于纤维素表面而增加底物与酶的接触;2) 裂解纤维素晶体表面的纤维素分子间的氢键。敲除 CBD 编码序列后获得的 CBH 对不溶性纤维素的水解活性明显下降, 而
14、对可溶性纤维素的降解作用没有明显影响。Cel1 和 Cel D 是来自 Aspergillus niveus 的属于 GH7 家族的两种 CBH, 它们有相似的 CD, 但前者有 CBD 后者没有, 发现 Cel1 对结晶纤维素降解活性明显大于 Cel D15。2.3 连接桥连接桥是一段高度糖基化的多肽, 它的长短控制着 CBH 的 CBD 和 CD 间的距离, 并对酶的构象和活性有显著影响。连接桥的有效长度及柔性是 CBH 发挥催化活性所必需的。丝状真菌 CBH 的连接桥一般包含 3040 个氨基酸残基, 而细菌CBH 则由约 100 个氨基酸残基组成6。3 纤维二糖水解酶的作用机理CBH
15、对游离纤维素链的水解机理首先是纤维素链结合到 CBD 上, 并推动其进入CD 的催化通道, CD 沿着纤维素链滑动, 进而从还原端或非还原端以纤维二糖为切割单元被降解 (图 1) 。CBD 与酶底物结合包括氢键结合和疏水作用16。但截至目前, CBH 对结晶纤维素的降解机理仍然不清楚, 其过程推测如下14-15:1) CBH 通过其 CBD 的介导吸附到结晶纤维素表面 (锚定) 4;2) 锚定的 CBH链在结晶纤维素表面扩散移动的过程中, CD 可识别到裸露于结晶纤维素表面的纤维素链末端 (还原端或非还原端) 并与之结合, 使糖苷键水解并释放纤维二糖。图 1 纤维二糖水解酶的作用机理46Fig
16、.1 The action mechanism of cellobiohydroalses46 下载原图4 纤维二糖水解酶的酶学特性表 2 给出了常见 CBH 的来源菌、分类及酶学特性。由表 2 可知, 不同 CBH 的最适 p H 范围为 3.09.0, 大多数位于 4.56.0 的范围内;最适催化温度为3570, 分子质量约 4070 k Da, CBH 的活性主要受 p H、温度、金属离子、产物反馈抑制以及其他成分的影响。COLUSSI 等17对来自 Trichoderma harzianum 的 CBH (Th Cel7A) 研究发现, 在 p H35 范围内, 酶活性随着 p H值增
17、大而提升;在 p H57 范围内, 酶活性随着 p H 值增大而降低。p H=5 时, 在 2050范围内酶活性随温度上升而增加;当温度超过 50, 酶分子发生变性其活性显著降低。WANG 等7发现, Hg 和 Ag 对来自 Neocallimastix patriciarum J11 的 CBH 有强烈抑制作用, 该菌的酶在大肠杆菌表达后, 加入10 mmol Hg 可使酶完全失活, 而 10mmol 的 Ag 使酶仅保留 9%的活性。而对来自产紫青霉 (Penicillium purperogenum) HBZ003 的 CBH, Fe 与 Mn 表现出较强的激活作用, Ca、Co、Cu
18、有弱的激活作用, 而 Mg、Zn 及 Al 则呈现抑制作用18。表 2 常见纤维二糖水解酶的来源菌、分类及酶学特性 Table 2 The origin, classification and enzymatic properties of common cellobiohydroalses 下载原表 酶解产物纤维二糖对 CBH 有反馈抑制作用, 尤其对 CBH的影响更明显8,19-20。KARI 等21发现, -型纤维二糖比 -型的抑制作用更强, 抑制常数可达 12.5mol/L。BARAMEE 等22发现, 低于 100mmol/L 的纤维二糖对来自Cellulomonas fimi 的
19、CBH 无抑制作用, 而在 255 mmol/L 时其抑制作用可达 50%。向反应液中添加 -葡萄糖苷酶、纤维二糖磷酸化酶23、纤维二糖脱氢酶24可有效消除反馈抑制。半胱氨酸可通过与 CBH 酶蛋白分子发生巯基-二硫键交换反应而引起酶失活25。可溶性木聚糖能与 CBH 的 CBD 结合, 从而竞争性地影响酶与纤维素链的结合而降低催化效率26。多酚类物质以及漆酶氧化形成的酚低聚物对 CBH 也有明显的抑制作用27。5 纤维二糖水解酶的分子进化来自于天然真菌的 CBH 虽然种类多, 但往往其酶产量不高, 适宜 p H 范围窄, 易发生热变性以及底物反馈抑制明显, 这些缺陷严重限制了 CBH 的工业
20、化应用。人们试图通过构建基因工程菌株来克服这些缺点。表 3 给出目前 CBH 基因工程菌株构建情况及对酶特性的改善情况。表 3 CBH 基因工程菌株构建宿主及酶特性改善情况 Table 3 Construction of CBH gene engineering strains and improvement of enzyme characteristics 下载原表 由表 3 可以看出, 目前构建 CBH 基因工程菌株选择的表达宿主主要有大肠杆菌、酵母 (毕赤酵母、酿酒酵母、解脂耶氏酵母等) 、丝状真菌 (木霉、曲霉和青霉等) 8。通过基因工程可有效提升 CBH 酶的热稳定性, 拓宽其适宜
21、工作 p H范围, 降低产物的反馈抑制作用以及提升酶的产量。但总的来看, 对酶热稳定性的改善效果较好, 但在提升酶产量等方面效果还不十分理想。6 商业纤维二糖水解酶酶制剂的生产情况目前用于商业纤维二糖水解酶酶制剂生产的菌株主要是里氏木霉 (Trichoderma reesei) 和长枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum) 。生产商业里氏木霉CBH 的公司主要有 Sigma-Aldrich、嘉汉生物科技有限公司和杰能科国际股份有限公司。如 SigmaAldrich 公司生产的 Celluclast 1.5L 以 Avicel 和 p NPC 为底物的比酶活分别为 0.
22、343 U/mg28和 0.06 U/mg29。而爱尔兰 Megazyme、安必奇 (Creative Enzymes) 和 BIOHJ 慧嘉生物等都利用长枝木霉生产。如Megazyme 的 CBHI 为无色粉末状, 易溶于水, 最适 p H 为 6.0, 以底物 CMC 为底物的比酶活为 0.1U/mg30。除此之外, 也有用其他微生物生产商业 CBH 的案例, 如嘉汉生物科技有限公司利用 Penicillium oxalicum JU-A10 生产的酶以p NPC 为底物的比酶活为 0.21 U/mg29。研究还发现, 来自真菌 (酿酒酵母、毕赤酵母和解脂耶氏酵母) 的 CBH 为高糖基化
23、 CBH, 对可溶性底物或非结晶纤维素活性低31, 但来自酿酒酵母的 CBH 很适合工业酒精的生产32。李亚玲等33研究发现, 来自嗜热毛壳菌 (Chaetomium thermophilum) CBH 的比酶活为 1.45 U/mg, 回收率为 5.25%, 半衰期为 1h (70) 。目前商业化 CBH 产品生产存在的主要问题是酶活性、酶热稳定性、p H 耐受范围均不理想。OLIVEIRA 等34发现来自 Humicolagrisea var.thermoidea 的 r CBHI.2 有较高的最适温度 (60) 、较宽的 p H 耐受范围 (p H4.09.0, 最适 p H 为 8.0
24、) 和良好的热稳定性 (70-240 min 可保留 88%活性) 。7 纤维二糖水解酶的应用7.1 在食品工业中的应用在食品工业中, CBH 主要可作为加工助剂提升加工效率或改善产品的品质。利用来自太瑞斯梭孢壳霉 (Thielaviater restris) 的 CBH 与商业酶CellicCTec2 共同对棕榈果进行前处理, 可大幅度提升其出油率, 其出油率与单独商业酶 Cellic CTec2 作用相比提升了 39%35。VAILLANT 等36在百香果汁中加入果胶酶 (85 U/L) 、CBH (100 U/L) 和内切葡聚糖酶 (700 U/L) , 在 30保温处理 1 h 可使其
25、中的果泥完全液化。向苹果匀浆中添来自黑曲霉 (Aspergillus niger) 的 CBH (29 U/m L) 和果胶酶 (50 U/m L) , 在 40处理 24 h 后获得的苹果混浊汁的稳定性显著改善5。在加工脆皮面包和饼干时, 向面团中添加羧甲基纤维素酶 (9 300 U/g) 、CBH (3 800 U/g) 和木聚糖酶 (2 500 U/g) , 可降低面包的吸水率并提升其加工性能5。在面包生产中使用CBH 酶制剂可减少乳化剂的用量37。7.2 在生物工程中的应用目前 CBH 的应用基本停留在实验室研究阶段, 规模化工业应用尚未实现, 核心原因是尚不能提供价廉物美的商业化酶制
26、剂或高产菌株。但就目前的研究情况来看, CBH 未来在生物工程领域的潜在应用主要包括纤维二糖的生产、生物燃料的生产、纤维性物料的改性等。纤维二糖是 CBH 作用于纤维素的主要产物, 它是重要的化工原料, 可作为生产山梨醇38、丙酮39、丁醇40、丁二醇41和乳酸41-42的原料。以嗜热芽孢杆菌属 (Thermophilic Bacillus coagulans) WCP10-4为例, 利用纤维二糖作为唯一的碳源, 不用额外加入 -葡萄糖苷酶就可有效地转化纤维二糖为 L-乳酸, 200 g/L 的纤维二糖转化为196.3 g/L 的 L-乳酸, 产率达到 97.8%41。由于能源的短缺, 生物燃
27、料的生产备受关注。为不与人争粮, 生物燃料生产的最佳原料应为自然界丰富的纤维素, 目前常用富含木质纤维素的农业废弃物 (秸秆等) 和固体垃圾 (餐饮垃圾等) 为原料生产43。其关键是将原料中的木质纤维素转化为可发酵的糖, 进而通过生物转化形成诸如乙醇的生物燃料。目前常采用含有内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、-葡萄糖苷酶等在内的特定纤维素降解酶组合来实现纤维素向可发酵糖的转化5,44-45。如利用可表达里氏木霉内切葡聚糖酶, CBH和棘孢曲霉 -葡萄糖苷酶酿酒酵母基因工程菌株作用于非结晶纤维素和离子液体溶胀纤维素, 60h 后发酵液中乙醇含量可达 2.1 g/L4。8 结语微生物来源的纤维二糖水解
28、酶具有良好的工业应用前景。在食品领域, 纤维二糖水解酶可与其他食品酶制剂协同降解水果及油料果实细胞壁多糖, 以利于提高出汁率或榨油率, 在酿造工业中, 可降解啤酒中的多糖, 以利于啤酒过滤澄清, 在其他工业领域, 纤维二糖水解酶可用于纤维二糖的生产, 纺织工业中天然纤维物料的改性, 以及能源工业中燃料乙醇的生产等等。虽然近年来对于纤维二糖水解酶的研究取得了突出成绩, 但仍存在许多值得深入探讨的问题:1) 纤维二糖水解酶作为纤维素酶大家族的一类关键酶, 其催化水解结晶纤维素的机制有待进一步明确, 比如酶与底物相互作用的精确模式、纤维二糖水解酶与其他纤维素酶的协同机制等;2) 获得具有商业价值的酶
29、制剂是纤维二糖水解酶走向工业应用的重要途径。一方面, 通过高通量筛选技术挖掘新的酶种;另一方面, 通过分子进化来改善酶的作用条件和催化性能, 对于食品用途酶的生产菌株, 还需重视来源菌株的安全性评价;3) 要进一步探索纤维二糖水解酶在食品领域的潜在利用方面, 如对结晶纤维素的有限可控降解, 使获得新型食品配料或添加剂成为可能。参考文献1GUSAKOV A V.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel productionJ.Trends in Biotechnology, 2011, 29 (9) :419-425. 2HAMID S B A,
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