1、聚羟基丁酸酯/聚乙二醇纳米复合支架的生物相容性研究 王译婕 王洁 万婉婷 杜婵媛 白乐康 邹蕊 西安交通大学口腔医学院陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室 西安交通大学口腔医学院口腔正畸科 陕西中医药大学附属医院 西安交通大学口腔医学院口腔修复科 摘 要： 目的:采用聚羟基丁酸酯 (polyhydroxybutyrate, PHB) /聚乙二醇 (polyethylene glycol, PEG) 纳米复合生物材料构建三维培养支架并与大鼠髁突软骨细胞 (condylar chondrocytes) 复合培养, 评价其生物相容性。方法:应用静电纺丝法制备 PHB/PEG 纳米复合生物支架, 将大鼠
2、髁突软骨细胞接种于PHB/PEG 支架上, 分别于复合培养 4h, 72h 时利用荧光显微镜及扫描电子显微镜观察细胞在三维支架上的粘附、铺展及生长情况, 并应用 MTT 四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法检测细胞的增殖活性, 评价其生物相容性。结果:荧光显微镜及扫描电子显微镜观察显示复合培养 4h 时细胞已粘附于支架表面, 部分细胞开始铺展, 培养 72h 细胞在支架表面增殖及生长良好, MTT 结果显示 PHB/PEG纳米三维支架复合培养大鼠髁突软骨细胞较对照组具有更高的增殖活性。结论:静电纺丝法制备的 PHB/PEG 纳米复合生物支架可以促进大鼠髁突软骨细胞的粘附、生长和增殖, 具有良好生物相
3、容性, 为组织工程软骨再生奠定一定的实验基础。关键词： 髁突软骨细胞; PHB/PEG 纳米支架; 复合培养; 生物相容性; 作者简介：邹蕊, 西安交通大学口腔医院正畸科, 副教授, 副主任医师, 硕士生导师, 科教科副科长;长期从事错牙合畸形的临床矫治、颌面部组织再生与修复、口腔生物力学等临床及科研工作;E-mail:收稿日期：2017-09-14基金：国家自然科学基金 (81300915) The Biocompatibility Study on Polyhydroxybutyrate/Polyethylene Glycol Nanocomposite ScaffoldsWANG Yi-
4、jie WANG Jie WAN Wan-ting DU Chan-yuan BAI Le-kang ZOU Rui Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research, Hospital of Stomatology, Xian Jiaotong University; Affiliated hospital of Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine; Department of Prosthodontics, Hosp
5、ital of Stomatology, Xian Jiaotong University; Abstract： Objective Three-dimensional nano composite biological scaffolds were prepared using polyhydroxybutyrate (PHB) /polyethylene glycol (PEG) and compound culture with rat condylar cartilages, to evaluate its biocompatibility. Methods The PHB/PEG n
6、ano composite biological scaffolds were prepared by electrospinning and the rat condylar cartilages were seeded in it. The adhesion, growth and spreading of cells were observed by fluorescence microscope and scanning electron microscope after seeding 4 h and 72 h, and evaluated cells proliferation a
7、nd scaffold biocompatibility using MTT. Results From the results of fluorescence microscope and scanning electron microscope, cells adhere on the scaffolds completely and some cells began spreading after 4 h, the proliferation and growth were better after 72 h. The results of MTT showed that PHB/PEG
8、 nanocomposite scaffolds can promote proliferation of rat condylar cartilages. Conclusion The PHB/PEG nanocomposite biological scaffolds have good biocompatibility and can promote adhesion, growth and proliferation of rat condylar cartilages, which will establish on experimental basis for tissue eng
9、ineering cartilage regeneration.Keyword： condylar cartilages; PHB/PEG nano scaffolds; compound culture; biocompatibility; Received： 2017-09-14髁突软骨是口腔颞下颌关节的重要结构, 是一种特化的、具有负重功能的结缔组织, 也是下颌骨主要生长中心之一, 可承受机械振荡刺激并将该刺激均匀传递至下方区域的骨组织1。正常范围的力学刺激有助于维持关节软骨结构和功能的完整性, 髁突软骨作为一种继发性软骨, 其发育后的继续生长与功能负荷密切相关, 而这一生物学特性是口腔
10、正畸功能矫形及修复咬合重建治疗的基础2-3。髁突软骨细胞是关节软骨的主要功能成分, 为了维持体外培养细胞表型以及生物学特性稳定, 选择合适的支架材料对其进行三维培养成为目前国内外的研究热点。众所周知, 生理性应力对细胞的作用是通过改变细胞生长的三维微环境而实现的, 细胞外基质微环境的空间物理结构显著影响细胞增殖分化及功能表达4-5。传统二维培养模式下细胞无重叠的分布方式在很大程度上简化和忽略了力学信号转导过程中细胞间、细胞和细胞外基质间的协同作用及相互依赖性, 并不能在体外精准模拟在体组织三维空间环境变化。随着实验方法的改进及研究内容的不断深化, 细胞力学实验已逐渐由早期二维细胞力学实验向生物
11、支架复合细胞三维力学加载过渡6-7, 从而获得与在体情况更加接近的体外细胞力学实验模型, 以期更加接近临床问题的力学实质。本研究应用静电纺丝法构建三维力学加载支架, 并与大鼠髁突软骨细胞复合培养, 研究 PHB/PEG三维支架的生物相容性, 为最终揭示三维培养细胞的力学信号转导机制及构建组织工程髁突软骨提供数据支持。1 材料和方法1.1 实验动物:SD 乳鼠 12 只, 出生后 35d, 雌雄不限 (西安交通大学医学院动物医学中心提供) 。1.2 实验试剂:高糖 DMEM 培养基 (Gibco Co, USA) ;胎牛血清 (G i b c o C o, U S A) ;青链霉素 (G i b
12、 c o Co, USA) , 型胶原酶 (Gibco Co, USA) ;0.25%胰蛋白酶 (Gibco Co, USA) ;四甲基偶氮唑盐 (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) (Sigma, USA) ;孔板 (Coning, USA) ;细胞培养皿 (Coning, USA) ;PBA 液, PBS 液等自行配制。1.3 仪器和设备:扫描电子显微镜 (Hitachi, TM-1000) ;酶联免疫检测仪 (Bio-Rad 公司) ;倒置相差显微镜及照相系统 (OLYMPUS FSX100) 。1.4 实验方法1.4.1 PHB/PEG 三维生物支架的
13、制备:将 2.7g PHB、0.3g PEG 溶解于 45ml 三氯甲烷并磁力搅拌 12h 使其充分溶解, 再与 5ml 二甲基甲酰胺 (DMF) 混合均匀制备 PHB/PEG 纺丝溶液。利用自组建的静电纺丝设备, 以 15k V 电压将 PHB/PEG 纺丝溶液以 1.2ml/h 的流速喷射出形成纺丝纤维。喷丝头方向垂直于接收屏, 且喷丝头和接收屏之间纺丝距离约15cm, 静电纺丝时间大约 1h, 从而制得薄膜状的多孔三维立体的支架材料。1.4.2 髁突软骨细胞培养及生物学鉴定:选择出生 35d 的大鼠乳鼠进行髁突软骨细胞的原代培养, 取第三代髁突软骨细胞行甲苯胺蓝染色及型胶原蛋白免疫组织化
14、学染色。1.4.3 大鼠髁突软骨细胞在 PHB/PEG 支架上的接种培养:取第三代大鼠髁突软骨细胞加 2ml 0.25%胰蛋白酶 37消化 23min, 以生长培养基终止消化, 稀释后反复吹打成细胞悬液, 以 ll0/ml 密度接种于 24 孔板内的 PHB/PEG 支架上, 每孔 1ml, 复合培养。1.4.4 复合培养细胞荧光显微镜观察:4h、72h 后将上述复合培养的 PHB 膜从孔板中取出, 置于载玻片上, 滴加荧光染色剂, 立即于荧光倒置相差显微镜下观察。1.4.5 复合培养细胞扫描电镜观察:4h、72h 后将上述复合培养 PHB 膜从孔板中取出, 固定, 室温过夜, 送检、制样、观
15、察。1.4.6 MTT 比色法检测大鼠髁突软骨细胞的增殖生长状态:将上述复合培养细胞及相同条件下的细胞培养板上的髁突软骨细胞, 分别培养ld、3d、5d、7d 后每孔加入 MTT 溶液 (5mg/ml) 100l, 37环境下孵育 4h。将孔内液体吸出, 每孔加入 600l 二甲基亚砜 (DMSO) , 即出现蓝紫色产物, 振荡 10min, 使甲瓒充分溶解。吸出蓝紫色液体后, 将其加入 96 孔板, 实验组和对照组各选 3 孔, 每孔 200l。在酶联免疫检测仪上选择 490nm 波长, 测定各孔吸收值, 记录结果, 以时间 (d) 为横轴, 光吸收值 (OD 值) 为纵轴绘制细胞生长曲线,
16、 设空白对照。通过以上方法与普通单层方法培养细胞进行对比, 分析 PHB/PEG 复合纳米纤维支架材料的细胞相容性。1.5 统计学分析:采用 SPSS 19.0 软件包, 对 MTT 结果重复测量数据行方差分析。2 结果2.1 大鼠髁突软骨细胞的生物学特性鉴定结果:第三代软骨细胞甲苯胺蓝染色观察, 绝大部分呈多角形, 胞浆内呈紫红色异染颗粒, 细胞周围有少量异染颗粒出现 (图 1A) ;型胶原免疫组织化学染色呈阳性结果, 胞浆被染成棕黄色 (图 1B) 。图 1 大鼠髁突软骨细胞的生物学特性鉴定结果 下载原图注:A.甲苯胺蓝染色;B.型胶原蛋白免疫组织化学染色2.2 荧光染色法观察细胞在三维支
17、架上的生长:将大鼠髁突软骨细胞与 PHB/PEG 三维生物支架复合培养 4h 荧光染色, 荧光显微镜下清晰可见亮染细胞核分布于支架表面及支架之间, 部分细胞已开始铺展;72h 镜下可见细胞明显铺展生长, 细胞核亮染而且数目明显增多, 细胞开始分裂增殖 (图 2) 。图 2 荧光显微镜下细胞支架复合培养结果 下载原图注:A.培养 4h 后;B.培养 72h 后2.3 扫描电镜 (SEM) 观察细胞在支架复合体上的生长状态:大鼠髁突软骨细胞与 PHB/PEG 三维生物支架复合培养 4h, 扫描镜下观察可见, PHB/PEG 三维支架表面及支架内上散在大量的髁突软骨细胞 (图 3A) , 多数细胞开
18、始粘附在支架表面呈球状, 有部分细胞开始伸出伪足 (图 3B) 。复合培养72h, 整个 PHB/PEG 支架表面可见密集排列的细胞, 与培养 4h 相比, 细胞数量明显增多, 并已在支架表面增殖、铺展, 相互重叠 (图 3C) 。高倍镜下可见细胞开始跨越多孔结构的支架孔隙和间隔, 覆盖于支架材料表面。有些地方可见增生的髁突软骨细胞几乎完全包裹纤维支架, 有部分细胞伪足伸入支架孔隙内部生长 (图 3D) 。图 3 扫描电子显微镜下髁突软骨细胞与 PHB/PEG 支架复合培养 下载原图注:A、C.培养 4h 后;B、D.培养 72h 后2.4 细胞增殖活性检测结果:MTT 结果表明 (图 4)
19、:实验组与对照组的大鼠髁突软骨细胞随着培养时间的延长而增殖。细胞接种第 1 天, 可见两组的髁突软骨细胞 OD 值均较低, 细胞逐步开始增殖生长;细胞接种第 3 天, 两组的细胞数量均增高, OD 值明显高于第一天, 但两组之间未出现显著性差异;细胞接种第 5 天, PHB/PEG 支架复合培养细胞增殖活力明显增高, 对照组细胞增殖活力虽有增长, 但显著低于实验组;细胞接种第 7 天, PHB/PEG 支架组细胞增殖活力仍呈现上升趋势, 对照组与第 5 天相比同样有少量增加, 可见增长曲线放缓。PHB/PEG 支架复合培养组细胞增殖活性显著高于对照组。图 4 细胞增殖活性检测结果 下载原图注:
20、*表示与对照组细胞培养板比较, P0.053 讨论聚-羟基丁酸酯 (PHB) 作为聚羟基脂肪酸酯 (PHAs) 家族中的一员, 由于其优良的生物相容性和生物可降解性, 在生物医学领域得到了广泛应用8-9。PHB 材料制成的多孔支架材料, 具有可支撑各种细胞存活的三维空间结构, 能够嵌入或携带细胞, 并提供良好的细胞生长环境10。通过调整支架材料的孔隙率及孔径大小, 可适应培养多种细胞的要求。但 PHB 材料表面呈现较高的疏水性和生物惰性, 材料本身强度欠佳。聚乙二醇 (PEG) 是一种水溶性的高聚物, 同时又是完全可降解材料, 无毒、无刺激性, 具有良好的水溶性, 与许多有机物有良好的相容性1
21、1-12。聚乙二醇 (PEG) 的引入, 可显著促进 PHB 材料的生物活性并提高其机械强度。细胞外基质的三维结构是细胞的生长和分化所依赖的微环境, 同时也是细胞内信号传递和化学反应的起始者, 可参与调控细胞分化及各种其他功能活动。越来越多的实验证据证明, 只有生长在三维基质微观环境中, 细胞形态才更接近在体细胞13。同时, 细胞形态、细胞骨架结构和细胞外基质的相互作用与细胞的代谢过程密切相关14。近年来组织工程技术的飞快发展, 为构建细胞的体外三维生长环境提供了可能。理想的组织工程支架材料应具备高度仿生的微观形态结构, 即具备适当的孔隙率、充分的表面积和适宜的表面化学, 从而促进细胞的黏附、
22、生长、增殖和分化。目前, 已有多种技术可用于制备满足以上要求的支架材料, 而静电纺丝技术能够制造出直径达纳米级的连续纤维15, 引起了学者们的广泛关注。因此本实验利用静电纺丝技术, 选用 PHB/PEG 复合生物材料制作髁突软骨细胞类胞外基质微环境支架, 为研究力学刺激下髁突软骨细胞的生物学行为变化奠定微观结构基础。良好的生物相容性是生物支架材料的重要性能之一。本实验将大鼠髁突软骨细胞与 PHB/PEG 纳米复合生物支架进行复合培养, 并进行形态学观察及细胞增殖活性检测, 初步证实了 PHB/PEG 纤维支架材料有利于细胞的粘附、生长、增殖, 具有良好的细胞生物相容性。荧光染色及扫描电镜观察从
23、定性的角度表征了支架良好的生物相容性, 细胞在接种 4h 粘附于支架表面并开始铺展, 而接种 72h细胞的增殖显著增加, 并呈现出三维生长。MTT 结果从定量的角度评价了大鼠髁突软骨细胞与 PHB/PEG 支架材料复合培养不同时间点细胞的增殖情况。检测结果显示, 培养前 3d, 与对照组相比, PHB/PEG 支架上复合培养的大鼠髁突软骨细胞数量虽略有增加, 但二者未出现显著差异;培养 57d 后, PHB/PEG 复合纤维支架上复合培养的大鼠髁突软骨细胞增殖活性明显高于对照组。由此可见, 静电纺丝技术制备的 PHB/PEG 纤维支架材料对大鼠髁突软骨细胞的粘附、生长、增殖具有一定的促进作用,
24、 具有良好的生物相容性, 并可为细胞生长提供良好的微观结构, 可为进一步研究力学刺激诱导髁突软骨损伤修复及再生重建提供新的组织工程材料。参考文献1Murphy MK, Mac Barb RF, Wong ME, et al.Temporomandibular disorders:a review of etiology, clinical management, and tissueengineering strategiesJ.Int J OralMaxillofac Implants, 2013, 28 (6) :393-414. 2Xie Q, Li X, Xu X.The diffic
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