1、牛乳腺炎无乳链球菌 PI-2a 菌毛岛屿辅助蛋白 BP、AP2 主要抗原域的串联表达及其免疫活性 朝洛蒙 王金良 布日额 吴金花 锡林高娃 陈金龙 孙立杰 王华 牛天明 内蒙古民族大学生命科学学院 内蒙古自治区乳源性致病菌防控工程技术研究中心 内蒙古民族大学乳源性致病菌研究所 内蒙古民族大学动物科技学院 山东省滨州畜牧兽医研究院 山东绿都生物科技有限公司 摘 要： 目的 构建无乳链球菌 (group B Streptococcus agalactea, GBS) 菌毛岛屿辅助蛋白 BP、AP2 主要抗原表位域融合表达重组质粒, 进行高效表达, 并分析其免疫活性。方法 利用 DNAstar 生物
2、信息软件 Protean 功能筛选 BP 和 AP2 主要抗原表位域, 并引入 15 位柔性多肽, 通过重叠延伸 PCR 技术扩增融合 BP、AP2主要抗原表位域基因, PCR 扩增串联体基因片段, 克隆至原核表达载体 p ET-30a (+) , 构建重组表达质粒 p ET-30a (+) /BP+AP2, 转化至大肠埃希菌 BL21 (DE3) , IPTG 诱导表达。表达的融合蛋白 BP+AP2 经亲和层析纯化后, 进行Western blot 鉴定, 并免疫昆明小白鼠, 检测其免疫原性。结果 PCR 扩增出675 bp 的 BP 和 759 bp 的 AP2 主要抗原域, 经重叠延伸
3、PCR 获得了 1 380 bp的 BP、AP2 串联体基因片段, DNA 测序结果表明, 无碱基的缺失、突变和移码。构建的重组表达质粒经诱导后获得表达, 目的蛋白相对分子质量约 55 000, 主要以包涵体形式存在, 纯化后纯度达 96%以上, 浓度为 2.05 mg/ml。纯化的融合蛋白能被兔抗 GBS 阳性血清所识别, 且具有良好的免疫原性。结论 构建了GBS BP、AP2 主要抗原表位域串联体重组表达质粒 p ET-30a (+) /BP+AP2, 表达产物具有良好的免疫活性, 为进一步研究基于 BP、AP2 蛋白的致病机制、诊断制剂及基因工程疫苗奠定了基础。关键词： 无乳链球菌; 菌
4、毛岛屿; BP; AP2; 串联表达; 免疫活性; 作者简介：布日额, E-mail:收稿日期：2017-03-31基金：国家自然科学基金项目 (31560689) Tandem expression and immune activity of major antigenic domain of ancillary proteins BP and AP2 in pilus island of Streptococcus agalactiaeCHAO Luo-meng WANG Jin-liang BU Ri-e WU Jin-hua XI Lin gao-wa CHEN Jin-long S
5、UN Li-jie WANG Hua NIU Tian-ming College of Life Science, Inner Mongolia University for Nationalities; Abstract： Objective To construct the fusion expression vector for the major antigenic domain of accessory proteins BP and AP2 in pilus island of Streptococcus agalactiae and analyze the immune acti
6、vity of expressed product. Methods The major antigenic domains of BP and AP2 were screened by DNAstar Protean software, in which 15 flexible peptides were introduced, and fused by overlapping extension PCR technique. The tandem gene fragment was amplified and cloned into vector p ET-30 a (+) . The c
7、onstructed recombinant plasmid p ET-30 a (+) /BP + AP2 was transformed to E. coli BL21 (DE3) and induced with IPTG. The expressed fusion protein was purified by affinity chromatography and identified by Western blot, of which the immunogenicity was evaluated by immunization of Kunming mice. Results
8、The major antigenic domains of BP and AP2, at lengths of 675 and 759 bp respectively, were amplified by PCR, based on which a tandem gene fragment at a length of 1 380 bp was obtained by overlapping extension PCR, which showed no base deletion, mutation or shift by DNA sequencing. The target protein
9、, with a relative molecular mass of about 55 000, mainly existed i n a form of inclusion body, and reached a purity of more than 96% and a concentration of 2. 05 mg/ml after purification. The purified fusion protein was recognized by rabbit anti-GBS positive serum, which showed good immunogenicity.
10、Conclusion Recombinant plasmid p ET-30 a (+) /BP + AP2 was constructed, and the expressed product showed high immune activity, which laid a foundation of further study on the pathogenic mechanisms, diagnostic kit and genetic engineering vaccines based on BP and AP2 proteins.Keyword： Streptococcus ag
11、alactiae; Pilus island; BP; AP2; Tandem expression; Immune activity; Received： 2017-03-31无乳链球菌 (group B Streptococcus agalactea, GBS) 是重要的人畜共患乳源性致病菌之一, 不仅引起奶牛乳腺炎, 还可引起罗非鱼的链球菌病, 新生儿脑膜炎、败血症及成年人的过敏性肾炎、过敏性心脏病等难以治愈的疾病1-2。每年因此造成的奶业、渔业经济损失巨大, 给人畜公共卫生带来了极大的安全隐患3-5。GBS 为奶牛乳腺炎最主要的致病菌之一, 在引起乳腺炎的过程中, 其首先要定植于奶牛乳
12、腺细胞表面, 该定植机制就是菌毛配体与乳腺细胞表面受体的识别结合, 然后才能在菌体细胞繁殖的过程中向周边释放透明质酸酶、溶血素等多种致病因子, 感染宿主细胞引起炎症及危害6-8。上述这些分泌性致病因子均属于非结构性毒力因子, 因此使得传统全菌体结构抗原制备疫苗的体液免疫效果不佳。自从发现 GBS 也存在与细胞黏附及感染密切相关的类菌毛样结构之后, 已成为全球相关学者关注与研究的前沿课题9。GBS 菌毛样结构在侵袭宿主细胞、细胞内运输、规避宿主上皮细胞对 GBS 的排斥方面起重要作用。同时菌毛具有良好的抗原性, BP (bone protein) 、AP2 (anciliary protein
13、2) 是编码菌毛岛屿蛋白基因簇中的 2 个有效保守性抗原组分10-11, 其菌毛骨架结构蛋白 BP 及辅助蛋白 AP2 具有与宿主靶细胞相互作用的黏附特性, 使细菌因“拉链效应”沿着菌毛进行连续黏附而定植于宿主细胞表面, 因此, BP、AP2 蛋白有望成为研究 GBS 检测抗原、致病机制及基因工程疫苗的理想候选抗原分子12-13。本实验通过生物信息学手段筛选、确定 GBS 菌毛岛屿辅助蛋白 BP 和 AP2 主要抗原域, 利用基因工程技术构建上述两个基因串联表达载体, 并进行 BP 和 AP2 蛋白的串联融合表达以及免疫活性分析, 以期为研究牛乳腺炎 GBS 的致病机制及新型免疫疫苗奠定基础。
14、1 材料与方法1.1 菌株及载体GBS 标准菌株 (批号:C55901) 购自中国兽医药品鉴定所;临床分离野生型 GBS 1886、p ET-30a (+) /BP 重组载体、p ET-30a/AP2 重组载体和 p ET-30a (+) 表达载体均为内蒙古自治区乳源性致病菌防控技术研究中心保存;p MD18-T 克隆载体、大肠埃希菌 DH5 和 BL21 (DE3) 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。1.2 实验动物SPF 级健康昆明小白鼠, 雌性, 5 周龄, 体重约 20 g, 购自山东中医药大学, 动物合格证号:SCXK (鲁) 20110003。1.3 主要试剂10PCR Buff
15、er、d NTP、Taq 酶、DNA marker DL2000、T4 连接酶、限制性内切酶 Bam H和 Xho及羊抗兔 Ig G-HRP 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;卡那霉素等均购自华美生物工程公司;质粒纯化试剂盒、DNA 清洁/PCR 产物清洁试剂盒和 DNA 提取试剂盒均购自维特洁生化技术有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物均为美国 OXID 公司产品;His 标签蛋白亲和层析柱为美国 GE 公司产品;兔抗GBS 血清为内蒙古民族大学乳源性致病菌研究所制备;DAB 和 TMB 底物溶液购自天根生化科技 (北京) 有限公司。1.4 BP、AP2 主要抗原域的确定采用 DNAstar
16、Protean 功能对 BP 和 AP2 基因进行抗原性和疏水性分析, 筛选主要抗原域, 为确保串联后抗原性, 在 BP 和 AP2 间引入 15 位柔性氨基酸残 (GGGGSGGGG-SGGGGS) 。1.5 BP、AP2 基因的融合通过 Over-PCR 技术将 BP 与 AP2 基因进行串联融合, 设计 4 条引物, 见表 1。第 1 轮 PCR:以 p ET-30a (+) /BP 为模板扩增 BP 基因, 以 p ET-30a (+) /AP2为模板扩增 Ap2 基因;第 2 轮 PCR:以第 1 轮 PCR 产物为模板, BP 上游引物/Ap2下游引物扩增串联 BP+AP2 基因,
17、 片段大小约 1 380 bp。其中重叠延伸 PCR 分2 步, 第 1 步 (不加引物) 反应条件:94预变性 4 min;94变性 30 s, 54退火 30 s, 72延伸 45 s, 共 5 个循环;725 min, 4终止。第 2 步 (添加引物 P1/P4) 反应条件:94预变性 3 min;94变性 1 min, 60退火 40 s, 72延伸 45 s, 共 30 个循环;7210 min, 4终止。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 经多功能 DNA 凝胶回收试剂盒回收后备用。1.6 目的基因的克隆及测序回收融合基因片段, 与 p MD18-T 载体连接, 转化至大
18、肠埃希菌 DH5, 筛选阳性克隆, 提取质粒, 送上海生工生物科技有限公司进行 DNA 测序。表 1 Over-PCR 引物设计 Tab 1.Design of primers for over-PCR 下载原表 1.7 重组原核表达质粒的构建用 Bam H和 Xho分别双酶切回收的融合基因片段及 p ET-30a (+) 原核表达载体, 切胶回收融合基因片段和载体片段后进行连接, 连接产物转化至感受态大肠埃希菌 DH5, 挑取单菌落培养, 提取重组质粒, 进行双酶切及 PCR 鉴定, 阳性质粒命名为 p ET-30a (+) /BP+AP2, 并送生工生物工程 (上海) 股份有限公司测序。1
19、.8 融合基因的诱导表达纯化后的阳性克隆转化至感受态大肠埃希菌 BL21 (DE3) 中, 37振摇培养至A600为 0.60.8 (约 3 h) 时, 加入终浓度为 1.0 mmol/L 的 IPTG, 37诱导表达 6 h, 收集菌体, 超声破碎, 分别收集上清和沉淀, 经 12%SDS-PAGE 分析目的蛋白的表达形式。1.9 融合蛋白的纯化及 Western blot 鉴定将 500 ml 诱导后的重组基因工程菌经 11 000g 离心 10 min, 收集诱导后菌体, 加入 20 ml PBS 重悬, 超声破碎细菌, 9 000g 离心 5 min, 收集沉淀, 经 8 mol/L
20、尿素变性复性后, 进行亲和层析纯化, 12%SDS-PAGE 分析纯化效果, BCA 法进行蛋白定量。纯化的 BP+AP2 融合蛋白经 12%SDS-PAGE 分离后, 转移至NC 膜上, 以兔抗 GBS 血清为一抗, 羊抗兔 Ig G-HRP 为二抗, Western blot 分析融合蛋白的反应原性。1.1 0 融合蛋白的免疫原性检测纯化的 BP+AP2 融合蛋白按照 11 的体积比分别加入弗氏完全佐剂 (初次免疫) 和弗氏不完全佐剂 (加强免疫) , 充分乳化后作为免疫原。取 10 只昆明小白鼠, 经背部皮下注射免疫, 免疫剂量 50g/只, 于初次免疫后 14 d 加强免疫 1 次,
21、分别于初次免疫后 0、7、14、28 和 35 d 采血, 分离血清, ELISA 法检测血清抗体水平 (以 A450值0.352 为阳性, 0.352 为阴性) , 评价 BP+AP2 融合蛋白的免疫原性。2 结果2.1 BP、AP2 主要抗原域的确定BP 和 AP2 编码基因经 DNAstar 软件分析筛选出得分最高的主要抗原域, 见图 1和图 2, 选取 BP 基因的 140364 位氨基酸, AP2 基因的 30282 位氨基酸为主要抗原基因扩增区域。在 BP、AP2 间加入 15 位柔性多肽, 经在线分析软件分析, 对 BP 和 AP2 融合后抗原性无影响。图 1 GBS BP 主要
22、抗原域分析结果 Fig 1.Major antigenic domain of GBS BP 下载原图图 2 GBS AP2 主要抗原域分析结果 Fig 2.Major antigenic domain of GBS AP2 下载原图2.2 BP、AP2 融合基因 PCR 扩增结果第 1 轮 PCR 扩增结果显示, BP 基因扩增产物大小 675 bp, Ap2 基因扩增产物大小 759 bp, 均与理论值一致;第 2 轮 PCR 扩增产物大小约 1 380 bp, 与 BP+AP2融合基因大小相符。见图 3。DNA 测序结果表明序列正确, 成功融合了 BP 和AP2 主要抗原域基因, 串联片
23、段大小为 1 380 bp, 无碱基的缺失、突变和移码。图 3 BP、AP2 主要抗原域基因 Over-PCR 融合结果 Fig 3.Fusion of major antigenic domain genes of BP and AP2 by Over-PCR 下载原图M:DNA marker DL2000;1:BP 主要抗原域基因 PCR 产物;2:AP2 主要抗原域基因PCR 产物;3:BP+AP2 融合基因产物。2.3 重组原核表达质粒的鉴定重组质粒经 Bam H和 Xho双酶切, 可见约 1 380 bp 的融合基因条带和 5 400 bp 的载体条带, 大小均与预期相符, 见图 4
24、。DNA 测序进一步证实, 重组表达质粒 p ET-30a (+) /BP+AP2 构建正确, 无碱基突变和缺失, 见图 5。2.4 表达及纯化产物的鉴定2.4.1 SDS-PAGE 分析表达的融合蛋白 BP+AP2 经 SDS-PAGE 分析, 在相对分子质量约 55 000 处可见特异性蛋白条带, 大小与预期相符, 目的蛋白主要存在于包涵体中, 包涵体经变性复性、His-Trap 亲和层析纯化后, 获得相对分子质量约 55 000 的单一蛋白条带, 纯度达 96%以上, 见图 6。经 BCA 法定量, 纯化蛋白的浓度为 2.05 mg/ml。图 4 重组表达质粒 p ET-30a (+)
25、/BP+AP2 的双酶切 (Bam H/Xho) 鉴定Fig 4.Restriction map of recombinant plasmids p ET-30a (+) /BP+AP2 (Bam H/Xho) 下载原图M1:DNA marker 2000;1:重组质粒的双酶切产物;M2:DNA marker15000。图 5 重组表达质粒 p ET-30a (+) /BP+AP2 的测序结果 Fig 5.Sequencing of recombinant plasmid p ET-30a (+) /BP+AP2 下载原图注:虚线部分为 BP 基因片段;实线部分为 AP2 基因;阴影区域为 l
26、inker;斜体加粗部分为酶切位点。图 6 表达及纯化产物的 SDS-PAGE 分析 Fig 6.SDS-PAGE profile of expressed and purified protein 下载原图M:蛋白质 marker;1:为诱导的 p ET-30a (+) /BP+AP2;2:诱导的 p ET-30a (+) /BP1+AP2;3:重组菌裂解上清;4:重组菌裂解沉淀;5:纯化的 BP+AP2 融合蛋白。2.4.2 Western blot 分析纯化的 BP+AP2 融合蛋白经 Western blot 分析, 在相对分子质量约 55 000 处可见特异性显色条带, 见图 7。表
27、明 BP+AP2 融合蛋白能被兔抗 GBS 抗体所识别, 具有良好的反应原性。图 7 纯化融合蛋白的 Western blot 鉴定 Fig 7.Western blotting of purified fusion protein 下载原图M:蛋白质 marker;1:BP+AP2 融合蛋白;2:阴性对照 (空载体诱导产物) 。2.5 融合蛋白的免疫原性ELISA 检测结果显示, BP+AP2 融合蛋白免疫 7 d, 小鼠血清抗体开始转阳, 14 d 免疫组小鼠抗体均呈阳性, 28 d 抗体水平达峰值 (11 600) , 35 d 时平均抗体维持在 11 200, 免疫前抗体为阴性, 见表
28、 2。表明 BP+AP2 融合蛋白免疫可有效刺激小鼠产生特异性抗体, 具有良好的免疫原性。表 2 小鼠免疫血清平均抗体测定结果 Tab 2.Determination results of mean antibody titer in sera of mice 下载原表 3 讨论MARTINS 等12对 898 株分离到的 GBS 相关基因序列分析结果表明, 在 GBS 中至少发现 1 种以上的菌毛毒力岛屿存在, 其中含 PI-1、PI-2a 菌毛毒力岛的比例最大, 分别占总数的 70%和 79%, PI-2b 菌毛毒力岛屿为 21%, 毛骨架蛋白 (BP) 、辅助蛋白 AP1 和 AP2 等
29、 3 个菌毛岛屿基因中均有相对保守的编码基因序列, 并提出这些菌毛岛屿亚基蛋白有望成为良好的抗原候选分子。本课题组对菌毛岛屿相关基因前期研究结果表明, GBS 的菌毛辅助蛋白 AP1 对于致病菌的黏附作用具有重要功能, 是一种重要的致病靶位配体, 而且通过动物实验证明, 牛源 GBS 菌毛岛屿辅助蛋白 AP1 对奶牛乳腺炎的免疫保护性可达 95%以上14。GBS AP2 蛋白能促使表面 BP 蛋白与侵染细胞受体结合, 为细菌对特定组织的定植与侵袭创造条件, 致使大量病原菌定植于宿主细胞而产生免疫反应, 并引发炎症。因此, 具有良好抗原性的 BP、AP2 蛋白是研究 GBS 亚单位疫苗的重要候选
30、抗原。本研究在综合分析 GBS BP 和 AP2 菌毛结构蛋白抗原性的基础上, 筛选确定了675 和 759 bp 的主要抗原域, 利用重叠延伸 PCR 技术, 构建了 BP、AP2 串联重组体。通过在 BP 和 AP2 基因间引入 15 位氨基酸的柔性多肽, 以确保 BP 和 AP2独立的抗原性, Protein 软件分析及表达蛋白的 Western blot 分析均表明, 引入的柔性多肽对融合蛋白抗原性无影响。将构建的重组表达质粒 p ET-30a (+) /BP+AP2 转化大肠埃希菌 BL21 (DE3) , 诱导表达了相对分子质量约 55 000 的融合蛋白 BP+AP2, West
31、ern blot 结果显示, 融合蛋白与抗 GBS 血清具有良好的反应性, 小鼠免疫试验表明, 融合蛋白免疫可有效刺激小鼠产生特异性抗体, 具有良好的免疫原性。本研究为进一步研制基于 BP、AP2 蛋白的 GBS 新型免疫制剂和诊断试剂奠定了基础。参考文献1BATISTA R P, FERREIRA C R.Streptococcus agalactiae septicemia in a patient with diabetes and hepatic cirrhosisJ.Autops Case Rep, 2015, 5 (4) :35-43. 2BARATO P, MARTINS E R
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