1、一种基于喹唑啉酮衍生物的荧光探针对次氯酸根离子的识别 姜亚男 汤立军 边延江 钟克利 侯淑华 渤海大学化学化工学院 摘 要： 次氯酸根 (ClO -) 在人体免疫系统中发挥着重要的作用, 其识别与检测备受关注。本文设计合成了一种含有喹唑啉酮骨架的腙型荧光探针 (HEMQ) , 并通过1H NMR、 13C NMR、高分辨质谱 (HRMS) 表征了其结构。探针 HEMQ 在 V (乙醇) V (水) =11 (c (PBS) =0.02 mol/L, pH=8.7) 溶液中对 ClO-具有良好的选择性且响应快速, 荧光发生显著猝灭。探针 HEMQ 对 ClO-具有较高的灵敏度, 检测限为 1.0
2、10-4mol/L。此外, ClO -可引起探针溶液由黄色到无色的颜色变化, 因此 HEMQ 可作为比色、荧光双通道响应的 ClO-探针。关键词： 喹唑啉酮; 荧光探针; 次氯酸根; 识别; 作者简介：汤立军, 教授;Tel:0416-3400302;E-mail:;研究方向:荧光探针收稿日期：2017-09-04基金：国家自然科学基金项目 (21476029, U1608222) A Quinazolinone Derivative-based Fluorescent Probe for Hypochlorite Ion RecognitionJIANG Yanan TANG Lijun B
3、IAN Yanjiang ZHONG Keli HOU Shuhua College of Chemistry and Chemical Engineering, Bohai University; Abstract： Hypochlorite (ClO-) displays essential roles in human immune system, the detection of which has aroused extensive attention.Herein, a hydrazone type fluorescent probe (HEMQ) that containing
4、quinazolinone skeleton was designed and synthesized, and the structure of HEMQ was characterized by 1H NMR, 13C NMR, and HRMS analysis.In V (ethanol) V (water) = 1 1 (c (PBS) = 0.02 mol/L, pH =8.7) solution, probe HEMQ exhibits rapid response and good selectivity toward ClO- through distinct fluores
5、cence quenching.HEMQ displays good sensitivity to ClO- with a detection limit of 1.0 10-4 mol/L.In addition, ClO- can induce a color change from yellow to colorless of the probe solution, thus, probe HEMQ can act as a colorimetric and florescent dual-channel ClO- probe.Keyword： quinazolinone; fluore
6、scent probe; hypochlorite; recognition; Received： 2017-09-04次氯酸根 (Cl O) 是一种重要的活性氧 (ROS) 物种, 因其显著的抗菌性质在人体免疫防御系统中发挥着重要作用1。然而, Cl O 的过量产生却能破坏人体组织并导致多种疾病, 包括心血管疾病2、动脉硬化3、肾病4和肺损伤5等。因此, Cl O 的有效检测备受关注。已经报道的检测 Cl O 的方法有很多, 主要包括碘量法6、比色法7等, 但这些方法往往操作复杂、响应时间长, 具有一定的局限性。由于荧光检测具有操作简单, 选择性和灵敏度高, 对样品无破坏等优点, 近年来备受
7、瞩目并成为检测 Cl O 的一种重要方法。迄今为止, 已经有大量的检测 Cl O 的荧光探针被相继报道8, 所采用的荧光团主要包括氟硼二吡咯 (BODIPY) 9-12、罗丹明13-14、荧光素15-17及苯并噻唑18等。对 Cl O 响应机制主要是依靠 Cl O 对探针中特定官能团的氧化反应, 通常将这些可反应基团引入探针结构中均较为繁琐, 造成探针的合成困难。尽管利用醛肟氧化成醛的反应是一种简单的探针设计策略, 但是醛肟还可被 Cl O 氧化成其它产物19-20, 缺乏专一性。因此, 充分利用 CHN 结构易于合成的优势, 设计合成新颖结构的 Cl O 荧光探针显得尤为必要。本文设计合成了
8、一种含有喹唑啉酮骨架的腙型荧光探针 (HEMQ) , 该探针在 V (乙醇) V (水) =11 (c (PBS) =0.02 mol/L, p H=8.7) 缓冲溶液中可快速、选择性识别 Cl O, 并且具有显著的肉眼可见的颜色变化, 可作为比色、荧光双通道响应的 Cl O 探针。探针 HEMQ 的合成路线如 Scheme 1。Scheme 1 Synthesis of probe HEMQ 下载原图1 实验部分1.1 仪器和试剂400-MR 型核磁共振仪 (NMR, 美国安捷伦公司) ;Bruker micr OTOF-Q 型高分辨质谱仪 (HRMS, 德国布鲁克公司) ;970CRT 型
9、荧光分光光度计 (上海三科仪器有限公司) ;SP-1900 型双光束紫外可见分光光度计 (UV-Vis, 上海光谱仪器有限公司) ;Model PHS-25B 型 p H 计 (上海大普仪器有限公司) 。如无特别说明, 实验所用试剂和溶剂均为市售分析纯, 实验用水为二次去离子水。活性氧 (ROS) H 2O2、Cl O、ROO、O 2和活性氮 (RNS) NO、ONOO 根据文献21-23方法制备。1.2 实验方法根据文献方法合成化合物 124和 225。将化合物 1 (280 mg, 1.0 mmol) 与化合物 2 (150 mg, 1.0 mmol) 加入到 100 m L 圆底烧瓶中,
10、 向其中加入 40 m L 乙醇, 搅拌下加热至回流反应 12 h。冷却至室温后, 过滤收集沉淀, 固体用冷乙醇洗涤两次后用 DMF 重结晶, 得到目标产物 HEMQ, 产率 49.6%。mp 256.4257.9。H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) , :14.84 (s, 1H) , 13.36 (s, 1H) , 12.60 (s, 1H) , 8.96 (s, 1H) , 8.30 (s, 1H) , 8.17 (d, J=8.0 Hz, 1H) , 7.99 (s, 1H) , 7.907.87 (m, 1H) , 7.81 (d, J=8.0 Hz, 1H) , 7
11、.76 (d, J=8.0 Hz, 1H) , 7.57 (t, J=7.6 Hz, 1H) , 7.39 (t, J=7.6 Hz, 1H) , 6.976.94 (m, 2H) , 2.69 (s, 3H) , 2.37 (s, 3H) ;C NMR (100 MHz, DMSO-d6) , :171.28, 160.29, 156.40, 135.57, 133.05, 132.14, 130.06, 128.10, 127.72, 126.52, 121.70, 119.40, 119.34, 117.66, 20.47, 14.95;HRMS 计算值 C24H21N4O3M+H413
12、.1614, 实测值 413.1622。2 结果与讨论2.1 荧光探针 HEMQ 对 Cl O 的选择性首先考察了荧光探针 HEMQ 对常见金属离子、阴离子、部分 ROS 和 RNS 的光谱响应。在 V (乙醇) V (水) =11 (c (PBS) =0.02 mol/L, p H=8.7) 缓冲溶液中, 探针 HEMQ (1.010mol/L) 在 593 nm 处呈较强的荧光发射。当向 HEMQ溶液中加入 Cl O 后, 荧光强度发生显著猝灭, 而加入其它金属离子 (Ca, Mg, Na, K) 、阴离子 (Ac O, Br, F, I, Cl, NO 2, NO3, OH) 、ROS
13、(ROO, H 2O2, O2) 和 RNS (NO, ONOO) 时, 荧光强度无显著变化, 表明探针 HEMQ 对 Cl O 具有良好的选择性。图 1 探针 HEMQ 对各种离子、活性氧及活性氮的荧光响应 Fig.1 Fluorescence response of probe HEMQ (1.010mol/L) toward different ions, ROS and RNS.ex=4 8 6 nm.Inset:fluorescence changes of HEMQ upon addition of different ions, reactive oxygen species a
14、nd reactive nitrogen species under illumination at 365 nm 下载原图1.HEMQ;2.Cl O-;3.1O2;4.ONOO-;5.H2O2;6.ROO-;7.NO;8.NO-2;9.NO-3;10.Ac O-;11.Br-;12.F-;13.Cl-;14.OH-;15.I-;16.Ca2+;17.Mg2+;18.K+;19.Na+为了进一步验证探针 HEMQ 对 Cl O 的选择性, 进行了紫外可见吸收光谱实验。在相同的缓冲溶液中, 向探针 HEMQ (5.010mol/L) 中加入 Cl O 后, 在 433 nm 处的吸光度明显降低,
15、 同时溶液颜色由黄色变为无色 (图 2) 。Cl O 可使探针 HEMQ 发生褪色, 可能是由于探针 HEMQ 与 Cl O 发生了反应, 破坏了探针原有的共轭结构所引起的。当向探针 HEMQ 溶液中加入其它离子、ROS 和 RNS 时, 其吸收光谱未发生显著变化。由此进一步证明探针 HEMQ 对 Cl O 具有良好的选择性。图 2 探针 HEMQ 对各种离子、活性氧和活性氮的紫外可见吸收光谱响应 Fig.2 UV-Vis absorption spectral responses of HEMQ (5.010mol/L) toward various ions, ROS and RNS.In
16、set:color changes of HEMQ solution on addition of various ions, reactive oxygen species and reactive nitrogen species 下载原图1.HEMQ;2.Cl O-;3.1O2;4.ONOO-;5.H2O2;6.ROO-;7.NO;8.NO-2;9.NO-3;10.Ac O-;11.Br-;12.F-;13.Cl-;14.OH-;15.I-;16.Ca2+;17.Mg2+;18.K+;19.Na+2.2 探针 HEMQ 对 Cl O 的传感性质为了考察探针 HEMQ 对 Cl O 的传感
17、性质, 测试了不同浓度的 Cl O 对 HEMQ (1.010mol/L) 荧光光谱的影响。如图 3 所示, 随着 Cl O 浓度的不断增加 (05.010mol/L) , HEMQ 的荧光强度逐渐变低并伴有微弱的蓝移, 当 Cl O 的浓度达到 5.010mol/L 时, 荧光强度降至最低且不再发生变化, 表明此时滴定已经达到饱和。根据荧光光谱图滴定数据, 采用归一化的荧光强度 (I-I min) / (Imax-Imin) 对 lg (c (Cl O) ) 作图, 得到了一条具有良好线性关系的直线 (线性相关系数=0.9989) 。该直线与横轴的交点即为 HEMQ 对 Cl O 的检测限2
18、6,由此计算出探针 HEMQ 对 Cl O 的检测限为 1.010mol/L。此外, 实验中发现探针 HEMQ 对 Cl O 具有较快的响应速度。如图 4 所示, 向 HEMQ 中加入 50 摩尔倍量的 Cl O 后, 经过 5 min 后荧光强度基本恒定, 表明 HEMQ 与 Cl O 的反应已经基本完全, 这为 Cl O 的快速检测提供了条件。2.3 p H 值的影响探针的荧光光谱通常依赖于测试体系的 p H 值。为了考察 p H 值对荧光探针HEMQ 识别 Cl O 的影响, 测试了在不同 p H 值下, HEMQ 与 HEMQ+Cl O 的荧光强度变化 (图 5) 。结果表明, HEM
19、Q 在 p H 值 812 范围内具有较强的荧光发射, 加入 Cl O 后, 在 p H 值 810 范围内荧光强度明显下降, 表明探针 HEMQ 适用于在弱碱性条件下 (p H 810) 对 Cl O 进行检测。2.4 探针 HEMQ 对 Cl O 的识别机理由于 Cl O 可使探针 HEMQ 溶液发生褪色, 推测可能是由于探针 HEMQ 与 Cl O 发生了可破坏 HEMQ 共轭结构的反应。为验证这一推测, 我们将 HEMQ 与 Cl O 在 V (Et OH) V (H 2O) =11 溶液中进行反应, 并将反应混合物与化合物 1 进行薄层色谱对比, 发现反应混合物中出现与化合物 1 具
20、有相同 Rf值的组分, 说明反应释放出了化合物 1。反应混合物的高分辨质谱中, 在 m/z=281.0917 处出现一强质谱峰, 可归属为化合物 1 的准分子离子峰M+H (计算值:281.0926) 。将这部分产物分离后, 与化合物 1 进行了 H NMR 对照, 发现二者的 H NMR 谱图相同 (图 6) 。这些结果表明, HEMQ 与 Cl O 发生了氧化反应, Cl O 将 HEMQ 中的亚胺基 (CH=N) 氧化为醛基27, 从而得到了化合物 1。图 3 探针 HEMQ 滴定不同浓度 Cl O- (05.010-4mol/L) 后的荧光光谱 Fig.3 Fluorescence s
21、pectra of probe HEMQ upon addition of different amounts of Cl O- (05.010-4mol/L) .Inset:linear relationship between normalized fluorescence intensity and lg (c (Cl O-) ) 图 4 探针 HEMQ 对 Cl O 的时间响应 Fig.4 Time-dependent fluorescence response of probe HEMQ to Cl O 下载原图图 5 探针 HEMQ 在有或无 Cl O-存在时荧光强度随 p H 值
22、的变化 Fig.5 Changes in fluorescence intensity of probe HEMQ (1.010-5mol/L) at different p H in the absence and presence of Cl O-图 6 化合物 1 (a) 与 HEMQ+Cl O-的分离产物 (b) 以及探针 HEMQ (c) 的部分1H NMR 谱图对照 Fig.6 Partial1H NMR spectrum comparison of compound 1 (a) , separated product of HEMQ+Cl O- (b) and probe HEM
23、Q (c) 3 结论设计并合成了一种基于喹唑啉酮类衍生物检测 Cl O 的荧光探针 HEMQ, HEMQ 对Cl O 表现为“On-Off”荧光信号变化。响应机制为 Cl O 氧化 HEMQ 中的亚胺基为醛基, 破坏了 HEMQ 的共轭结构。探针在 p H 值 810 范围内对 Cl O 具有良好的选择性和较好的灵敏度, 且响应快速。加入 Cl O 后, 探针溶液呈现从黄色到无色的颜色变化, 因而可以作为 Cl O 的“裸眼”探针。对含有喹唑啉酮骨架的荧光探针进行精心结构设计和修饰, 有望获得性能良好、可用于生物学检测的荧光探针。参考文献1Lambeth J D.Nox Enzymes, RO
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