1、 生物制药信息 2008年6月 发展中的清大天一 u 2008 BioProcess Tour讲 药发 断创 个 术座：生物制的展需要不 新的性化支撑技 u 征集 议建 与 资索取料 微载体细胞培养原理与方法（连载） u 第一章 简介 细胞培养技术问题讨论专栏 u 药过 见问题汇总生物制 程常 （2） 疫苗行业信息 u 2008 国 场年中疫苗市展望 u 扩 产大疫苗生 u 研 从艾滋病疫苗究何去何 u 关于手足口病已知有限 未知更多 研科薄弱 u 肠道病毒EV71 带动 研发热感染事件或 新疫苗 u 国药监发 国 药 号家 局布我首支人用禽流感疫苗品批 u 国内甲肝疫苗 场竞争市 激烈 u
2、样颗 节 选 临 研基于病毒 粒的三价季性流感候疫苗床前究 u 结核再次肆虐 关疫苗如何把好第一？ u 将进 试验瑞典明年 行尼古丁疫苗人体 u 国中禽流感疫苗 走在世界前列 u 滨兽医研 研发动 实现产业哈尔 究所 物疫苗 化 基因诊断和抗体药物 u 术为医学发带来变康熙雄：生物芯片技 展 革 u 国 疗我 找到治癌症 新方法 疗应可有效消除化 反 u 国 研获进英抗 生素 究新展 其他信息 u 国美 FDA将 国 药监 构在中建 立 品 督分支机 ？ u GMP标将领药业药 产观准引 制 企 品生的 念更新 u H5N1 际传病毒可能的人 播 u 给国药监难题中制 管 把脉 u 欧盟新GM
3、P 将指南 生效 国医我 药 业应关出口企 予注 u 欧盟“GMP指南” 质风险引入量 管理 024681012140 20 40 60 80 100Time(hr)celldensity(106 cells/ml)BHK21 cell growth curve PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第1页 发展中的清大天一 2008 BioProcess Tour讲 药发 断创 个 术座：生物制的展需要不 新的性化支撑技 尊敬的专家： 当前全球生物制药技术正在迅猛发展, 仅在2006年全球除疫苗外的
4、销售额超过10亿美元的12类畅销生物技术药物的销售总额达到638亿美元, 全球疫苗销售额130亿美元, 全球动物疫苗的销售额36.6亿美元。而占全球67亿人口的20, 有13亿人口的中国, 2006年生物（包括生化药品在内）企业销售收入为390亿元人民币, 约55亿美元。就技术而言, 全球生物制药采用反应器的在70左右，而中国的采用率不足10, 疫苗行业（包括人用疫苗和兽用疫苗）还不足5。这些技术差距、市场和人口的反差、以及持续高速发展的经济给中国生物制药行业带来了宝贵的历史发展机遇，同时也带来严峻的挑战。谁能掌握和应用不断发展创新的生物制药生产支撑技术，谁就能在发展中脱颖而出发展壮大，否则就
5、会落后也可能陷入困境。 GE和清大天一携手, 希望通过一系列的技术交流活动，把包括生物反应器、微载体、个性化细胞培养基的现代细胞培养技术和包括过滤、层析等的现代生物纯化技术作为现代生物制药生产全过程中支撑技术及其最新进展与各位专家分享； 并针对不同类别的生物制品中的生产需要, 设计和提供不断创新的个性化技术和服务，以希望对大家有所启发有所帮助。我们更期盼中国早日诞生象AMGEN、GENENTECH、巴思德、GSK、英特威、梅里亚这样的生物制药巨无霸。 通用电气医疗集团生命科学部 (GE Healthcare Life Sciences) 从2007年下半年起开始在北美、欧洲和亚洲多个国家举办了
6、BioProcess Tour讲座。在沈阳、上海、深圳和兰州，通用电气医疗集团生命科学部及其战略合作伙伴清大天一的联合讲座受到中国生物制药行业的热烈欢迎。2008年4月24日在兰州举办的研讨会更是创下了有近200位来自生物制药生产企业的管理层, 主要专家和技术人员参会的记录。（下图，兰州研讨会座无虚席的会场） 2008年 6月 3日, 这个讲座将来到生物制药技术前沿的首都北京, 希望能和更多的专家分享和交流。讲座将围绕如何利用先进的生物制药生产支撑技术提高企业生产效率和竞争能力，由两家公司的资深技术人员在下列方面作重点的介绍： 新型Wave (波浪)生物反应器和微载体在细胞培养放大中的应用 o
7、 Wave 生物反应器的特点与应用 o 微载体在细胞培养中的应用 生物制品生产企业如何判断细胞培养基产品的品质 o 如何理解和有效实施细胞培养基国家化工行业标准 o 国内细胞培养基市场存在哪些罕为人知的质量隐患 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第2页 o 如何对细胞培养基生产企业进行质量审计 细胞培养基的个性化，以及反应器细胞大规模培养技术 o 个性化细胞培养基及细胞培养基的定制和委托生产 o VERO和MARC145细胞在50L/100L反应器中的微载体(Cytodex I)培养技术 o BH
8、K21细胞在生物反应器中的全悬浮培养技术 o CHO细胞在WAVE反应器中应用无血清细胞培养基的案例 过滤技术在生物制药纯化过程中的应用与优化方法 o 过滤技术及滤器的选择 o 过滤过程的优化与在实际生产中的应用 层析技术在生物制药纯化过程中的应用与优化方法 o 层析技术的基本原理与应用 o 层析技术在单抗和疫苗生产中的案例 新型ReadyToProcessTM 产品介绍 o RTP是应对突发疫情的新武器 o RTP 是CMO厂商的好伙伴 生物制药领域的清洗与验证 o 生物制药中设备与过程验证的基本要求 o 清洗验证过程的考量与实施 期待您和您同事的光临！ GE电气医疗集团生命科学部 大中国区
9、工业业务总监：杨于京 北京清大天一生物技术有限公司 总经理：张韧 BioProcess Tour讲现场 撷座 采 兰州会议讲座现场座无虚 清大天一陈文庆副总在讲细胞培养基知识 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第3页 议与 资征集建 索取料 自2007年清大天一与GE生命科学在沈阳和上海共同举办生物技术研讨会后，今年再次联合在深圳和兰州举行生物技术交流会，并且在 6 月时这个讲座将来到生物制药技术前沿阵地北京, 届时希望能和更多的专家分享和交流。 生物技术研讨会受到了业内专家学者的大力支持和热烈响
10、应，很多企业领导和奋斗在研发生产一线的技术骨干和技术专家都从百忙中抽身来到会议现场，对此，我们对各位领导和专家表示由衷的感谢。同时我们希望各位医药行业的同仁能够给我们这样的研讨会提出好的建议，使我们在将来的工作中做得更加完美。我们也希望和各位医药厂家进行更多的技术交流，对共同关心的生物制药过程中的问题进行探讨，相互促进，取长补短，共同进步。 清大天一一直坚持技术服务为宗旨，因此自主编写了大量技术资料，如生物制药信息，细胞培养技术文集，细胞培养基手册，生物反应背景下细胞基的选择和个性化发展方向，细胞技术进展等，我们欢迎各位同行专家来电索取，以下是联系方式。 地址：北京市昌平科技园区白浮泉路11号
11、 邮编：102200 电话：（010）80110248 80110922 传真：（010）80110230 Email： 现场听众积极提问 陈文庆副总和王建超博士在解答听众问题 宣传展板 讲座期间发放资料 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第4页 微载体细胞培养原理与方法（连载） 从本期生物制药信息开始我们将陆续连载微载体细胞培养原理与方法一书（本书由GE生命科学组织翻译），本书共有11章内容，包括简介、微载体背景、微载体技术、应用、微载体产品、微载体培养设备、培养条件、微载体在生产中的应用、生产
12、考虑、优化培养条件、问题解决等。本期转载第一章内容。 第一章 简介 现今的生物技术产品生产最迫切的要求是更快的速度、更低的成本和更多的适应性。理想的情况是，一个生产单元是集成的（需要更少的投资），并且具有标准的组件（可以用于不同的生产流程）（图1）。因此，使得同一个工厂能够培养不同细胞类型（细菌、酵母、昆虫细胞，加上悬浮和贴壁依赖型动物细胞）的设计具有很大的优越性。动物细胞培养被持续不断地开发以提高单位细胞的生产力，从而使动物细胞产品的成本更有竞争力。由于动物细胞具有相对低的产生力，每临床剂量的终产品都需要大量的细胞培养上清。例如，生产数kg 治疗用的单克隆抗体就需要极大的培养体积。 图1a
13、生产工艺流程图 图1b. 不同反应器的构造（Courtesy of Polymun Scientific GmbH,Vienna, Austria.） 目前，动物细胞悬浮培养已经达到15,000 L 规模，贴壁依赖型细胞的微载体培养业已达到6,000 L 规模（图2）。两者都是大的单元操作。随着操作规模的增大，物力和人力的投入也大大增加。细胞培养的条件也更加重要，一旦培养失败代价将更为惨重。 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第5页 Fig.2. 流感疫苗生产工厂（6000L容器，Vero细胞生长
14、在CytodexTM上） Courtesy of Baxter Biosciences. 大规模细胞培养生产力的提高可以通过在2-3106/mL细胞密度下放大到大体积，或者通过在更小的体积内增大细胞密度（达到2108 /mL）来强化培养过程。提高细胞密度时，需要更频繁的更换培养液，最后还需要应用灌注培养。有许多相互竞争的技术可供选择。微载体培养贴壁依赖型细胞或者被俘获的细胞降低了体积/细胞密度比，因此属于前面提到的第二种提高生产力的方法。对于商品制造者来说，此项技术具有诸多优点。它可以用于分批模式或者灌注模式，也适合于高效的过程开发和优化放大（图3）。此外，还可以改进反应器用于其它生物体的生长
15、。本书回顾了细胞培养生产中使用微载体培养的原理和方法。 图3a 不同的微载体及其应用 图3b. 不同的微载体培养装置 1.1 载使用微体 的原因 细胞培养技术已经成为一项研究动物细胞的结构、功能和分化、以及生产许多重要的生物物质如疫苗、酶类、激素、抗体、干扰素和核酸等所必需的技术。微载体培养引入了新的可能性，而且第一次使得实际的贴壁依赖型细胞的高产培养成为可能。在微载体培养中，细胞在小球表面呈现单层生长（图4）或者在大孔结构中呈现多层生长，那些大孔结构通常在温和的搅拌下在培养基中悬浮。在简单的悬浮培养、流化床或填充床系统中使用微载体，每ml可能得到2108细胞。 PDF 文件使用 “pdfFa
16、ctory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第6页 图4. 猪肾细胞 (IBR-S2) 接种后在Cytodex上生长72h的扫描电子显微镜照片 （原图来自G. Charlier, INVR, Brussels, Belgium, 经允许转载） Cytodex 微载体是Amersham Biosciences（现在是GE Healthcare 的一部分）专门为培养体积从几毫升到几千毫升不等的各种动物细胞的高产量培养而开发的（5.1.3 小节）。基质为葡聚糖的两种类型的Cytodex 微球，基质是纤维素的两种类型的CytoporeTM 微球
17、和基质为聚乙烯的两种类型的CytolineTM 微球都很好地满足了对微载体系统的特殊需求。 Cytodex: 表面特征经过优化，适于细胞高效粘附和伸展； 大小和密度经过优化，有利于均匀悬浮，适于宽范围的细胞优良生长和高产； 基质是生物惰性的，为搅拌培养提供了一个坚硬但是非刚性的底物； 透明，贴附的细胞用简单的显微镜就能观察到； Cytodex 的广泛应用证明了它在微载体培养技术中的重要性和价值。 Cytopore: Cytopore 是一种大孔微载体，是基于Cytodex 逻辑的开发，能够增加细胞密度（从而提高产量）并可用于细胞悬浮培养和灌注培养。 Cytoline: Cytoline 是一种
18、大孔微载体，能够用于流化床技术，在Cytopilot 发酵装置中利用了它们相对重的特性在细胞培养中能够均一的分布。 1.1.1 会 动 细 养 应新机和在 物 胞培 中的用 微载体为动物细胞生长提供了便利的表面或者提高了标准单层培养容器和灌注室的细胞产量。微载体的应用包括大量的细胞、病毒和细胞产物的生产，细胞分化和功能的研究，灌注培养系统，显微镜方法的研究，收获有丝分裂的细胞，分离细胞，膜研究，细胞的储存和运输，涉及细胞转移的分析，以及细胞捕获标记化合物的研究等（见第4章相关叙述）。 1.1.2 产提高生 能力 微载体系统提供的极大的培养表面积/体积比（例如，1ml中使用5mg Cytodex
19、 就得到30cm2表面积）提供了高的细胞产量而无需凭借大容量的设备和单调的方法。相对于其他类型的单层培养而言，微载体培养需要相当少的空间，就可生产一定量的细胞或细胞产物（图44）。当使用致病性生物体生产时，在小的集成系统中培养细胞就显得尤为重要。 1.1.3 从 产 细分泌的品中 分离胞 微载体技术是一种细胞保留的方法（图5）。也就是说，稀释速率（灌注速率）与细胞生长速率无关。第二，由于收获液中只有很少的细胞，下游的分离过程就变得更简单。你可以将部分澄清步骤转移返回到发酵过程中。 PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止
20、境 生物制药信息 第7页 图5. 不同的截留系统 1.1.4 进改 的控制 微载体系统使培养参数（例如pH、气体压力等）极好控制。此技术提供了一种方法使得贴壁依赖型细胞能够在一个拥有所有悬浮培养优点的系统中生长。改进的控制能够使各种过程设计的培养系统环境均一（1）。微载体培养的监测和取样比其他任何一种用于大量贴壁依赖型细胞生产的技术都简单。 1.1.5 护细 学压保 胞抵抗物理和化 力 大孔微载体能够保护细胞免受搅拌桨的轻击，特别是大规模培养的时候。由于这种保护作用，用纯氧微泡起泡通气也是可能的。如果细胞在微载体的孔内创造了一个微环境（图6），则它们将能够耐受更大的化学压力，如乳酸、氨和氧。
21、图6. 细胞满意地入座在孔内的图示 1.1.6 减 对养少培 基的需求 与其他单层或悬浮培养技术相比，一定体积的培养基情况下，搅拌微载体培养的细胞产量能够高达100倍。好的细胞产量已经在各种系统中得到报导，包括鸡成纤维细胞（2, 3），猪肾细胞（4），鱼细胞（5），中国仓鼠卵巢细胞（6），人成纤维细胞（7），原代猴肾细胞（8），以及转化鼠成纤维细胞（9）。对培养基需求的减少意味着细胞培养成本的大大节省（6,9），尤其是使用昂贵的血清如胎牛血清时。大孔微载体为细胞专门提供了一个极好的微环境，使之能够交换他们自己产生的生长激素，因此可以使用无蛋白的培养基。 1.1.7 减劳 动少 力需求 由于可以
22、在小体积中培养大量的细胞（高于1011 cells/L），微载体培养需要更小的培养容器。例如，一个技术工人每周能够处理900个用于疫苗生产的滚瓶（10）。1L微载体培养可以生产相当于50个滚瓶（490 cm2 的滚瓶，2）的细胞产量，并且1-1.5mL 的大孔微载体与一个850cm2滚瓶的细胞产量相当。这个微载体相关的简化过程减少了常规生产所需要的劳动力。从培养液中分离细胞是很简PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第8页 单的：停止搅拌，粘附有细胞的微载体在重力作用下沉降下来，上清就可以取出。与真正
23、的悬浮细胞培养系统所不同的是，微载体培养不需要离心步骤。 1.1.8 污 风险降低 染的 在细胞培养中，污染的风险与生产特定量细胞或产物所需的处理步骤（如，打开和关闭培养容器）是相关联的。微载体培养减少了处理步骤的数量。在单个微载体培养系统中与在几百个滚瓶中生产大量的细胞相比，前者大大降低了污染的风险（6）。 1.2 书本 的目的 本书阐述了用Cytodex，Cytopore 和Cytoline 微载体达到最优细胞培养结果的原理和方法。虽然此项技术是动物细胞培养中最先进的技术之一，但是它不限于有经验的细胞培养者。因为细胞培养被大量的科学家使用，本书既适合于细胞培养初学者也适合于有经验的科研工作
24、者。只要具有一定的细胞培养的基础知识即可。 本书的目的是帮助读者通过最少的努力设计和操作最优的过程，并且一致达到高产的结果。所有的已经开发用于Cytodex，Cytopore，Cytoline 的方法不一定适合于其他的细胞培养表面。 细胞培养技术问题讨论专栏 药过 见问题汇总生物制 程常 （2） 五 细胞培养过程常见问题 1. 为什么培养的细胞要及时传代？ 答：体外培养的细胞大多具有生长接触抑制的特性，也就是说当一个细胞被其他细胞包围的时候，它就会停止生长，及时传代后，细胞的生长得以继续。 2. 培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？ 答：通常细胞生长得非常快时，pH 值通常下降
25、得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3 缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。 （1）按培养液中 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内 CO2 浓度，2.0g/L 到 3.7g/L 浓度 NaHCO3对应CO2浓度为5到10。 （2）改用不依赖CO2培养液。 （3）松开瓶盖1/4 圈。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。 （4）在CO2 培养环境中改用基于Earles 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。 （5）如果是污染造成的则
26、丢弃培养物或用抗生素除菌。 3. 培养液pH对细胞生长的影响？ 答：由于大多数细胞适宜pH为7.2-7.4，偏离此范围可能对细胞生长将产生有害的影响。但各种细胞对 pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对 pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些。在配制培养用液时，需要注意一点：培新配的培养基在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。 4. 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？ 答：研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。建议细胞解冻
27、后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第9页 基即可。但对于DMSO敏感的细胞，还是复苏细胞时，用离心去除DMSO比较好。 5. 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？ 答：研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，原因比较复杂，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；细胞置于80 太久等。建议严格参照ATCC或ECACC的标准操作规
28、程进行细胞复苏、冻存等工作。 6. 支原体污染会对细胞培养有何影响？ 答：支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数、代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。 7. 冷冻保存细胞之方法？ 答：冷冻保存方法一: 冷冻管置于4（3060 分钟）-20( 30 分钟) -80（1618 小时或隔夜） 液氮罐长期储存。 冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降 1-3至80 以下， 再放入液氮中长期储存。注意：-20不可超过 1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降
29、低一些。 8. 悬浮细胞应如何继代处理？ 答：一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养瓶中，稀释细胞浓度即可。若培养液太多时可分瓶取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养瓶中，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。 9. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 答：欲回收动物细胞，其离心速率一般为300g (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速过长时间都将造成细胞死亡。合适的离心转速是根据相对离心决定。 RCF=1.119 105r(rpm)2 r 为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离；rpm 为离心机每分钟的转数；RCF(relative eentrifug
30、al force)为相对离心力，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍数来表示表示单位。 10. 培养细胞时应使用5%还是10%CO2，或者根本没有影响？ 答：一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7g时，细胞培养时应使用10% CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5g 时，则应使用5%CO2培养细胞。 11. 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？ 答：除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后
31、，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养方瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 12. 冷冻管应如何解冻？ 答：取出冷冻管后，须立即放入37水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在12 分钟内大部分融化，特别注意，需残留一小块冰块，就可拿到超净工作台操作细胞，用75消毒冻存管，用新鲜培养基将细胞转移至培养瓶。另外冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。 13. 如何用台盼兰计数活细胞？ 答：将样品适当稀释后，用稀释后的样品和0.4的台盼兰溶液按1:1混合后，用移液枪点样到血球PDF 文件使用 “pdfFactory
32、Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第10页 计数板，置于倒置显微镜下观察、计数，其中蓝色细胞是死细胞，因活细胞排斥台盼兰，不被染色。 14. 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 答：冷冻管内细胞数目一般为1-8106 cells/ml vial。 15. 细胞冷冻培养基之成份为何？ 答：动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含9 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞
33、液中，必须使用前先行配制完成。 16. 如何消除组织培养的污染？ 答：当重要的培养细胞污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。
34、在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度 23 倍浓度的抗生素的培养液培养细胞 23代。 5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 6）重复步骤4。 7）在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。 17. 培养细胞出现死亡其可能的原因有什么？解决办法有哪些？ 答：可能的原因有培养箱内无CO2；培养箱内温度波动太大；细胞冻存或复苏过程中损伤；培养液渗透压不正确；培养液种有毒
35、代谢产物堆积等。 解决办法可以检测培养箱内CO2浓度，检查培养箱内温度；取新的保存细胞种；检测培养液渗透压等；换入新鲜培养液等。 18. 国内可以买到细胞株的地方有哪些？ 答：可以从国内多家代理厂家买到ATCC或ECACC的细胞株，同时国内可以买到细胞株的地方还有中国医学科学院（协和医科大学）基础医学部，中国科学院细胞研究所以及武汉大学冷藏中心等。 19. 细胞的渗透压耐受性是多少？ 答：细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。人血浆渗透压290mOsm/kg, 可视为培养人体细胞的理想渗透压。鼠细胞渗透压在 320mOsm/kg 左右。对于大多数哺乳动物细胞，渗透压在2
36、60320mOsm/kg的范围都适宜。 20. 支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？ 答：不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。 21. 怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？ PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第11页 答：ATCC (American Type Culture Collection) 收集了绝大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索AT
37、CC的细胞数据库。数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。 22. 为什么要在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白酶溶液? 答：胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。 疫苗行业信息 2008 国 场年中疫苗市展望 来 国源：疫苗中 从非典到禽流感，从流感到一些普通的疾病，疫苗作为与健康息息相关的产品，不管是人用疫苗还是兽用疫苗，越来越受到人们的关注。疫苗市场也在不断的酝酿和发展，2008 年疫苗市场会如何走向，疫苗中国的专家认为可以从以 下几个方面进行分析。 对 场一、 疫苗市的 分析 现在在中国市场上的疫苗
38、一共有两大块，一块是国内自己生产的疫苗，还有一部分是国外在中国注册的疫苗，国外在国内的市场上排在前三位的企业是辉瑞、英特威和梅里亚。 在疫苗产品中兽用疫苗占整个疫苗市场的20%，兽用疫苗在疫苗市场中是前、点、元的的概念。在全球中疫苗的主要市场是北美和西欧，占到 50%左右，主要是因为这些国家的畜牧业发达，且美国、日本控制着疫苗的价格，在1998年以后疫苗产品的种类以 80%的速度在增长，其中以亚洲占据领先水平。 场二、疫苗市的 特点 1.条块性：与动物品种息息相关； 2.经济特性：受畜牧业经济状况的影响，市场的变化，科学技术的进步都会使疫苗市场受到影响。 3.法规特性：受法律、法规的变化影响非
39、常大。 场变三、市 化的方向 1.使用更安全、更有效的基因工程疫苗 2.发现新的免疫途径3.调节免疫期，传播母源抗体4.创造特殊的免疫接种工具。 对 国四、 中疫苗的 思考 1.简化、改进、加速新产品的审批。 建立专职审批制度,一站式。建立快速审批制度（如口蹄疫疫苗疫苗和禽流感）。建立自家疫苗审批制度。质量标准有效性的评价观念的转变，从免疫攻毒保护试验向提高生产性能评价的 转变。生产性能评价可为三个层次：产品可预防的病的种类；产品有助于预防病的种类；能够提高某个动物的生产性能。 2.提高新产品开发力度:加大对疫苗新产品投入资金。 3.关键技术的创新和应用。 （1）原材料改进技术，病毒产品使用传
40、代细胞，基因工程细菌，细菌产品方向是合成培养基。 （2）培养技术，病毒产品使用微载体反应器，细菌产品使用发酵系统。 （3）纯化技术 （4）浓缩技术在国内用的比较少，是一个努力的方向。 （5）降低动物实验，将动物实验降到最低度尽量不用动物作实验；精化和提高。 4.疫苗的品种创新 （1）各类联苗的创新，特别是猪的联苗（猪瘟、猪丹毒、猪肺疫），此外，还有病毒与细菌的联苗及灭活疫苗与活疫苗的组配。 （2）细菌类疫苗的创新。 （3）人畜共患传染病疫苗 （4）灭活疫苗发展的方向是高效免疫佐剂。 希望国内的疫苗企业加速发展，在疫苗市场增大和国外企业的竞争力。 扩 产大疫苗生 来源: 术生物技 世界 由于现代
41、疫苗十分繁琐，因此随着需求不断增长，医药公司面临着生产上的挑战。 依靠疫苗可以保护人群远离疾病，这需要大量的疫苗。事实上，需求才是扩大生产首要原因。2007年11月7日，伦敦Datamonitor公司预测,到2016年，儿童和青少年的疫苗市场将是现在的4倍，从2006年的43亿美元增长到160亿美元。为满足需求，需大批量的进行疫苗生产。 “疫苗生产是一个挑战，规模越大，难度越高，”赛诺菲-巴斯德公司的William Reed博士PDF 文件使用 “pdfFactory Pro“ 试用版本创建 http:/ http:/ 技术无止境 服务无止境 生物制药信息 第12页 说道。用生物工程生产的疫苗
42、的性质是造成困难的部分原因。疫苗的生产过程并非像小分子生产那样简单的混匀几种化合物即可，医药公司要经过一系列的步骤，其中包括发酵。正如Reed所言，“这是生物工程，要掌握其性质并进行控制是非常困难的。因此，这可以说是一半科学，一半艺术。” 以前，科学家们制备疫苗的方法是在发酵箱内培养细菌或病毒，杀死这些微生物使其毒性减弱，然后差不多将其罐装保存。但是现在的疫苗生产依靠更加繁琐的工艺。例如默克公司的Gardasil一种抗人类乳头瘤病毒（HPV）的疫苗要经过一系列的步骤才能得到。“HPV病毒外壳的遗传信息被注入到酵母中，”默克研究实验室的 Barry Buckland 博士解释说，“随着酵母细胞在
43、发酵箱内不断繁殖，它们培育出类似病毒的微粒，或者称为VLP，它们和真正的病毒看起来很象，却没有内容物。”发酵好后，收集这些酵母细胞，将其破碎以释放VLP。经过提纯之后，它们就可被用作疫苗了。 因此，扩大疫苗生产需要的不仅仅是更大的容器。事实上，在增加产量的同时保持疫苗的活性需要各种技术支持，其中包括生产、开发和功效检测试验。“最根本的挑战在于生产出成千万支疫苗的能力。” 扩 规 约大 模的微妙制 “化学工程的反应条件是固定的，而且经过充分的研究，” 韦氏生物技术公司的Dave Zisa说道，“但是疫苗生产涉及的生物工程，由于使用的是活的生物体，其中变数成倍增多。”所以，疫苗生产并非总能按比例增
44、加。“对于其中一个环节来说，你可以那样按比例提高，”Zisa说道，“但是你不能随意操纵放大生物工程的产量，那是个特殊的领域。” 举例来说，反应试剂的稍稍变动，将会导致疫苗的功效和生产效率上的巨大改变。“任何一种培养基中都存在许多微量成分，它们的含量低于现有分析手段所能检测到的水平，”Reed 说道，“有些成分需得被放大好几倍才能被检测到。这些原料中微量成分的改变，将导致疫苗生产过程的巨大变化。”如果这种变化降低了产物的质量，赛诺菲-巴斯德公司的科学家们建立了一个“过程精通小组”，来检测什么因素导致了这种变化。“然后分析小组来努力专门检测什么东西发生了变动，”Reed 介绍说。“同时，原料小组努力辨认原材料中引入的和这种变化相关联的特殊成分。” 成倍扩大产量更加复杂，调控机构将整个生产过程当作产品的一部分进行审查。“如果你对生产过程作了一些变动，你得知道将产生什么效果，”John Picken 说道；John Picken 是个化学工程学的理学学士，任比利时 Rixensart 市葛兰素史克生物公司北美产业关系的副总裁。“但有时我们就是不知道将会发生什么，所以要么从开发小组那儿获取更多的信息，要么就得试上一试。” 大规模扩大疫苗产量还和时机有关。例如，流感疫苗的生产只限于需要的
