1、 蒲黄总黄酮对 3T3L1 脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体家族 mRNA 基因表达的影响【摘要】 观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）对脂肪细胞糖脂代谢和过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor, PPAR）家族基因表达的影响，并分析其改善胰岛素抵抗的可能机制。方法：蒲黄总黄酮干预 3T3L1脂肪细胞，实时定量荧光多聚酶联反应检测脂肪细胞分化相关基因PPAR 家族，包括 PPAR、PPAR 和 PPAR/ mRNA 的表达。结果：蒲黄总黄酮可上调 PPAR、PPAR mR
2、NA 的表达，下调 PPAR/ mRNA 的表达，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P0.01）。结论：蒲黄总黄酮可能通过提高 3T3L1 脂肪细胞PPAR 和 PPAR mRNA 的表达改善胰岛素抵抗。 【关键词】 脂肪细胞 蒲黄总黄酮 游离脂肪酸 PPAR 家族Objective: To explore the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on the mRNA expressions of peroxisome proliferatoractivated receptors (PPARs) , , / so as to a
3、nalyze its possible mechanism in improving the insulin sensitivity of 3T3L1 adipocytes.Methods: Adipocytes were treated with PTF, and expressions of PPAR、PPAR、PPAR/ mRNAs relating to the adipocyte glucose and lipid metabolism were determined by reverse transcription polymerase chain reaction.Results
4、: PTF obviously upregulated the expressions of PPAR and PPAR mRNAs, all showing significant differences as compared with those in the normal control group (P0.01).Conclusion: With its function as an insulin sensitizer, PTF may enhance the PPAR and PPAR mRNA expressions in 3T3L1 adipocytes.Keywords:
5、3T3L1 adipocyte; Pollen Typhae total flavones; free fatty acid; peroxisome proliferatoractivated receptors游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的溢出是早期胰岛素抵抗及其靶器官代谢异常的中心环节之一，也是近年来代谢领域研究的重点1。脂肪组织是机体能量调节器官，其脂肪代谢及糖代谢的异常在早期胰岛素抵抗发生发展中起着极其重要的作用。蒲黄是调节血脂的常用中药，对胰岛素抵抗亦有改善作用2。在临床上广泛应用于糖脂代谢异常的患者。本研究所在前期的细胞学实验中也发现蒲黄的有效成分蒲黄总黄
6、酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）可改善成熟脂肪细胞的葡萄糖消耗和游离脂肪酸的溢出3。本次研究通过观察蒲黄总黄酮对 3T3L1 脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor, PPAR）家族基因表达的影响，进一步探讨蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗的机制。1 材料与方法1.1 药物和试剂 罗格列酮（rosiglitazone，ROS）由浙江天马制药有限公司提供；蒲黄总黄酮由上海信谊药业有限公司提供；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeccos modified Eagles medium,
7、DMEM）和 TRIzol 由 GIBCO 公司提供；地塞米松、异丁基甲基黄嘌呤和胰岛素购自 Sigma 公司；油红 O 购自 Sigma 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)为 SinoAmerican Biotech公司产品；逆转录酶 AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒为 BioBasic公司产品；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增试剂盒购自 Invitrogen 公司。1.2 细胞培养及分组 3T3L1 细胞株购自 America Type Culture Collection 公司，其培养与诱导分化方法
8、同文献4。将 3T3L1前脂肪细胞接种于培养板，用含 10%小牛血清的高糖 DMEM 培养，待细胞融合 2 d 后，加含 0.5 mmol/L 异丁基甲基黄嘌呤、0.25 nmol/L 地塞米松和 10 g/ml 胰岛素的 10%胎牛血清高糖 DMEM 培养 48 h，换以含 10 g/ml 胰岛素的含 10%胎牛血清培养液再培养 48 h，随后以 10%胎牛血清高糖 DMEM 继续培养，2 d 换培养液 1 次，诱导分化 812 d，3T3L1 细胞 90%呈脂肪细胞表型1。将 24孔培养板中分化成熟的脂肪细胞以含 0.2% BSA 的 DMEM 培养基培养 12 h 后，分为空白对照组（不
9、加药）、蒲黄总黄酮组（ 0.2 g/L）和罗格列酮组（5 mol/L），药物均使用去离子水配置，药物干预培养 24 h。1.3 PPAR mRNA 表达 采用实时定量 PCR 法检测。药物处理同上，抽提细胞总 RNA，以 AMV 第一链 cDNA 合成试剂盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PPAR 上游引物：5TTT CAA GGG TGC CAG TTT CG3 ；下游引物：5GGG AGG CCA GCA TCG TGT A3 。PPAR 上游引物：5TAC GGC AAT GGC TTT ATC AC3 ；下游引物：5CCC TCC TGC AAC T
10、TC TCA AT3。PPAR/ 上游引物：5TGC GGC AAC GTG AAA GGA AT 3；下游引物：5ACG CGG TAT CCA CGT CAA GTA3。看家基因甘油醛3磷酸脱氢酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物：5AAG GTC GGA GTC AAC GGA TT3；下游引物：5CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT3 。参照试剂盒说明书，反应体系为 25 l，内含 5PCR Buffer 5.0 l，Mg2+ 0.3 l，dNTP 0.75 l，引物 1.0 l，25SYBR Gre
11、en1.0 l，校准液 1.0 l，Ex Taq 酶 0.25 l，ddH2O 14.7 l ，模板 1.0 l。实时定量 PCR反应在 Cotbett RotoGene 3000 实时定量 PCR 仪中进行。反应程序为：95 预变性 10 s，60 (GAPDH)退火 30 s，55 延伸 10 s，共 80 个循环，每个循环结束后采集荧光信号。最后绘溶解曲线以确定反应产物无引物二聚体及非特异性扩增。当荧光信号强度超过基线时，其域值循环数（cycle threshold，Ct ）被记录下来。在实时定量 PCR 中， Ct 值被认为与被扩增基因的初始浓度密切相关。扩增后根据 Ct 值及标准曲线
12、计算出目的基因拷贝数与 106 GAPDH 的相对值。1.4 统计学方法 采用 SPSS 11.0 for Windows 统计软件对实验结果进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，计量资料数据用xs 表示。2 结 果蒲黄总黄酮组 3T3L1 细胞 PPAR、PPAR mRNA 表达量均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P0.01），但低于罗格列酮组，差异亦有统计学意义（P0.01）。蒲黄总黄酮组3T3 L1 细胞 PPAR/ mRNA 表达量低于正常对照组和罗格列酮组（P0.01）。见表 1。表 1 3T3L1 脂肪细胞 PPAR、PPAR 和PPAR/ mRNA 表达3 讨 论脂肪代
13、谢的改变及其对糖代谢异常的影响在早期胰岛素抵抗的中心作用一直是国内外研究的热点。研究药物对脂肪细胞糖脂代谢的影响，对于防治与胰岛素抵抗密切相关的 2 型糖尿病、血脂异常、脂肪肝和动脉粥样硬化等代谢性疾病的发病及减轻其危害具有重要意义。近年来 FFA 在胰岛素抵抗的发生发展中的核心作用正成为倍受关注的研究热点。前期研究已经证实，蒲黄总黄酮可直接抑制成熟 3T3L1 脂肪细胞 FFA 的外溢，同时可改善脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用，提示蒲黄总黄酮可改善脂肪及葡萄糖代谢，由此对胰岛素抵抗特别是早期胰岛素抵抗有一定的改善作用3。 PPARs属激素核受体超家族成员，由 PPAR、PPAR、PPAR/ 3
14、 个亚型组成。其中，PPAR 在脂质代谢中起着关键的调节作用 5。PPAR 活化可以调节与脂肪酸氧化有关的基因的转录，参与脂质代谢、能量动态平衡和胰岛素敏感性等生物学过程的调节等。PPAR最具脂肪组织特异性，对脂肪细胞的分化起着重要作用6，并在一定程度上抑制脂肪组织分泌 TNF 等脂肪细胞因子，有利于改善胰岛素抵抗7。PPAR/ 近年才受到广泛关注，也被发现与脂肪生成和脂质代谢调节有密切关系8。大量研究表明，PPARs 的调节剂有望成为 2 型糖尿病、肥胖、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病的治疗药物。PPAR 的激动剂贝丁酸和 PPAR 的激动剂噻唑烷二酮类（thiazolidinediones,
15、 TZD）药物，已被临床成功用作降脂药和胰岛素增敏剂。PPAR/ 的激动剂可能会通过对骨骼肌的作用而成为另一个新型胰岛素增敏及降脂药物。因为 3 种 PPAR 亚型在代谢综合征的发病中作用不完全相同，所以近来的研究集中于开发一种全新的药物，使其要么具有更高的选择性，要么具有两个或全部PPAR 活化特性。 PPAR/PPAR 激动剂 tesaglitazar 就被认为可改善脂肪餐后的糖脂代谢9。TZD 类药物罗格列酮是目前治疗胰岛素抵抗的代表药物，它促进PPAR 表达增加和脂肪细胞的分化，促进葡萄糖转运，增加脂肪组织胰岛素敏感性，但却有肥胖等脂质积聚的副作用6。我们的实验结果表明蒲黄总黄酮可提高 PPAR 和 PPAR mRNA 的表达，说明它能在一定程度上改善胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱。而且蒲黄总黄酮促进脂肪细胞的分化，促进 PPAR mRNA 表达的效应与PPAR 激动剂罗格列酮相似，但 PPAR mRNA 的上升幅度却小于罗格列酮，说明其在脂肪细胞的积聚这一副作用可能小于罗格列酮。这对临床选择治疗胰岛素抵抗中药有一定的指导作用。但蒲黄总黄酮改善胰岛素敏感性的确切机制及能量的去处尚有待于深入研究。而且，在体内的作用与离体的作用并不完全相同，会受到其他因素的影响，因此进一步研究蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗的机制，探究其在体内的作用及影响因素是一项颇具意义的工作。【
