1、 葡萄糖神经酰胺合酶与白血病细胞耐药的关系作者：谢平，葛素梅，沈云峰，顾中华，穆会君，张滨【摘要】 本研究旨在观察葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase ,GCS）基因及其蛋白在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。首先以 -actin基因为内参照物，采用 RT-PCR 方法分析了 53 例耐药/非耐药白血病患者外周血标本，并对药物敏感的HL-60 细胞株和对阿霉素耐药的 HL-60/ADR 细胞株中 GCS 基因的表达水平进行检测，同时与多药耐药基因（mdr1）的表达进行比较。继而采用 Western blot 法分析 HL-60 细胞株及 HL-60/
2、ADR 细胞株中GCS 蛋白及 P-gp 蛋白的表达情况。结果表明：白血病患者耐药组临床标本中的 GCS 基因扩增条带光密度相对比值明显高于非耐药组（P0.05），且 GCS 基因扩增条带光密度值显著增强时往往伴有mdr1 基因的高表达，两者呈正相关（P0.01、r 0.6）。HL-60/ADR 细胞株 GCS mRNA 及蛋白均过度表达，且明显高于 HL-60细胞株，与此同时， HL-60/ADR 细胞株的 mdr1 mRNA 和 P-gp 的表达亦显著增高。 结论：GCS 可能在白血病多药耐药中起着重要作用。 【关键词】 葡萄糖神经酰胺合成酶；多药耐药 ；白血病 ；HL-60 细胞；HL-
3、60/ADR 细胞Relation Between Glucosylceramide Synthase and Multidrug Resistance in Leukemia CellsAbstractThis study was purposed to explore the expression of glucosylceramide synthase (GCS) in human leukemia cells and its relationship with multidrug resistance. RT-PCR was used to analyze peripheral blo
4、od samples from 53 leukemia patients with multidrug resistance/non-resistance, and to detect the expression level of GCS gene in HL-60 cells and HL-60/ADR cells, the expression level was compared with the level of mdr-1. The expressions of GCS protein and P-gp prolein in HL-60 cells and HL-60/ADR ce
5、lls were assayed by Western blot analysis. The results showed that the relative optical density ratio of GCS gene amplified bands in samples of leukemia patients with drug- resistance was significantly higher than that in samples of leukemia patients with drug non-resistance group (P0.05), meanwhile
6、 the significant enhancement of optical density value of GCS gene amplified bands accompamied by high expression of mdr-1 gene. Their correlation showed positive (P0.01, r=0.6). The GCS mRNA and protein were overexpressed in HL-60/ADR cells, and their expression levels were obviously higher than tha
7、t in HL-60 cells, meanwhile the expression of mdr-1 mRNA and P-gp also significanfly increased in HL-60/ADR cells. It is concluded that the high level of GCS in leukemia patients possibly is associated with multidrug resistance of leukemia cells.Key wordsglucosylceramide systhase; multidrug resistan
8、ce; leukemia; RT-PCR; Western blot analysis化疗是治疗白血病的主要手段，而多药耐药（multidrug resistance, MDR）导致的化疗失败则是白血病治疗中困扰临床的重大难题。目前国内对 MDR 的研究较集中在药物转运泵的作用致药物外排增加从而产生耐药。为了进一步探讨白血病耐药的相关机制及寻找逆转白血病细胞耐药的靶标，我们将从另一条新的途径即神经酰胺信号系统中葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase, GCS）的表达水平对白血病细胞耐药作用进行研究。材料和方法临床标本53 例白血病患者标本全部来自无锡市第一人民医
9、院，其中男31 例，女 22 例，年龄 18-82 岁。经临床、细胞形态学、免疫学等项检查，符合全国统一的白血病诊断标准。 治疗缓解标准按照 1987 年全国白血病防治研究协作会议拟订的白血病疗效标准规定，未达到缓解标准为耐药。在 53 例中耐药 27 例，非耐药 26 例。细胞株包括人类白血病细胞株 HL-60 及阿霉素耐药株 HL-60/ADR。细胞培养将细胞维持在含 10胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 g/ml链霉素的 RPMI 1640 培养液里，并置于 37，5 CO2 的培养箱中进行细胞培养和传代。RT-PCR mRNA 分析RNA 抽提采用 TRIzoL 提取法抽提外
10、周血标本的单核细胞及培养细胞的总 RNA，并通过检测其在 A260 和 A280 处的吸光度，计算 RNA 含量及纯度。引物设计利用计算机软件 primer premier 5.0 辅助设计 3 对引物，经 BLAST 比对确认其特异性后由上海生工生物公司合成，其核苷酸序列见表 1。Table 1. Oligonucleotide sequences of primers for GCS, mdr1 and -actin（略）RT-PCR 扩增使用随机引物对 GCS 、mdr1 及 -actin基因的mRNA 进行逆转录反应。PCR 扩增条件为：94 5 分钟, 94 60 秒, 55 45
11、秒, 72 45 秒,共 30 个循环，72 5 分钟。PCR 扩增产物检测 RT-PCR 扩增产物在 2琼脂糖凝胶上经100 V 恒压电泳 30 分钟后，取出该凝胶在凝胶分析系统上拍照，分析各样本扩增条带的光密度值。Western blot 分析蛋白质样品制备将细胞培养至 3107，去除培养液并用 PBS 溶液冲洗 2 遍。使用 1 mmol/L 的冷 TNT 溶液（20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 200 mmol/L NaCl, 1.0% Triton X-100, 1.0% mmol/L PMSF, 1.0%抑蛋白酶肽）裂解细胞，60 分钟 后经 12 000g
12、离心 15 分钟以去除未溶解的细胞碎片，并收集上清液测定其蛋白浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE ）电泳取 150 g总蛋白上样进行 SDS- PAGE（Invitrogen 公司产品），于 125 V 恒压电泳 90 分钟以分离蛋白质样品。蛋白质电转移及免疫学检测经 25 V，2 小时电转移后，用封闭试剂（3去脂奶粉，10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0, 150 mmol/L NaCl, 0.05% Tween-20）对转移膜进行封闭。分别使用抗 GCS 抗体或抗人Pgp 单克隆抗体（抗体浓度稀释 11 000）检测样本中的 GCS 蛋白或 P-gp 蛋白。最后采用 EC
13、L 试剂 （Amersham 公司产品）曝光显色。统计学分析将各样本的 GCS 和 mdr1 基因扩增条带的光密度数据分别与-actin基因的光密度数据相比得出各样本的光密度相对比值，然后对耐药组和非耐药组 GCS、mdr1 基因表达的光密度相对比值进行两样本均数比较的 t 检验及线性相关分析。数据以 XSD 表示，P0.05 为显著性差异。结果临床标本中 GCS 和 mdr1 基因的表达经统计学处理，耐药组 GCS、mdr1 基因扩增条带的相对光密度值较非耐药组均显著增高（P0.05）（表 2）；且 53 例白血病标本中 GCS 与 mdr1 基因的表达存在线性正相关（P0.01； r 0.
14、6）。Table 2. Comparison of relative OD values of GCS and mdr1 genes in clinical samples between drug-resistance and non-drug resistance groups（略）培养细胞中 GCS mRNA 和蛋白的表达RT-PCR 检测结果显示，HL-60/ADR 耐药细胞株的 GCS mRNA 表达明显高于 HL-60 细胞株； 同样 Western blots 分析也显示，HL-60/ADR 耐药细胞株的 GCS 表形即 GCS 蛋白的表达亦明显增高，与 RT-PCR 实验结果相
15、符（图 1）。培养细胞中 mdr1 mRNA 和 P-gp 蛋白的表达实验结果表明,HL-60/ADR 耐药细胞株的 mdr1 mRNA 和 P-gp蛋白的表达非常显著，而在 HL-60 细胞株却几乎未见 mdr1 基因及其蛋白的表达（见图 2）。讨论神经酰胺（ceramide）被认为是作为一种介导细胞凋亡和导致细胞分化生长阻滞的脂质类第二信使，其在肿瘤细胞对抗癌治疗（包括化疗和放疗）的反应中起到了重要作用1-4。阿霉素、紫杉醇及依托泊苷等抗肿瘤药物可促进从头合成神经酰胺或加速神经鞘磷脂水解并生成神经酰胺，诱导肿瘤细胞凋亡5。若神经酰胺生成障碍，则会导致抗癌治疗对肿瘤细胞的毒性效应减弱，从而产
16、生耐药。 葡萄糖神经酰胺合成酶（ GCS）则是一种细胞膜蛋白，可催化神经酰胺生成葡萄糖神经酰胺（glucosylceramide）,继而阻断神经酰胺的第二信使作用，并促进细胞分裂、增殖与生长。因此，MDR 细胞内 GCS 含量的升高可能是其逃避凋亡，从而导致细胞耐药的一条重要通路6，7。我们采用白血病患者外周血临床标本、白血病细胞株 HL-60 及耐药株 HL-60/ADR 对 GCS 与白血病细胞耐药的关系进行了研究。实验结果显示，GCS 基因在临床白血病耐药及非耐药组中的表达水平存在差异，即耐药组 GCS 基因的表达明显强于非耐药组，两组间具有显著的统计学差异。而白血病细胞株体外培养实验结果亦表明：HL-60/ADR 耐药株 GCS 的 mRNA 及蛋白均过度表达，且明显高于 HL-60 细胞株。由此说明了 GCS 可能与白血病细胞的耐药相关。此外，我们还发现临床白血病标本 GCS 基因表达显著增高的同时伴有 mdr1 基因的高表达，GCS 基因表达与MDR 存在正相关； HL-60/ADR 细胞株的 mdr1 mRNA 和 P-gp 蛋白亦显著增高，因此应进一步证实在白血病耐药的产生过程中存在着几种机制的共同作用及相互影响。【
