1、牛樟芝鲨烯合酶基因的克隆与表达分析 原晓龙 赵能 华梅 陈剑 杨宇明 王娟 王毅 云南省林业科学院云南省森林植物培育与开发利用重点实验室国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育重点实验室 西南林业大学林学院 摘 要： 为了解牛樟芝三萜类生物合成、调控机理, 以多孔菌科真菌茯苓 (Wolfiporia cocos, AFR13032.1) 的 SQS 基因为模板对牛樟芝基因组数据进行本地 Blast, 分离获得牛樟芝鲨烯合酶 (AcSQS) 基因.以该序列为模板设计特异引物 Ac SQSF0 和 Ac SQSR0, 通过 PCR 扩增得到 Ac SQS c DNA 全长, 并对其进行生物信息学分
2、析, 检测不同碳氮源添加物的培养基上该基因的表达水平.结果显示:克隆得到的基因为牛樟芝鲨烯合酶 (Ac SQS) , 该基因含 4 个外显子, 3 个内含子, 外显子拼接总长 1 803 bp, 编码 600 个氨基酸;其蛋白序列的 117 位为信号肽位点, 具两段跨膜结构, 可能定位于内质网;位于该蛋白 189204 位的CHYVAGLVGEGLTRL 和 225238 位的 MGLMLQKTNIIRDY 的保守基序为鲨烯合酶识别位点, DTIEDD 和 D (Y/F) RED 为 FPP 绑定位点;蛋白网络分析显示其位于三萜类化合物的代谢网络中;聚类分析显示 Ac SQS 蛋白和茯苓、硫磺
3、多孔菌、拟蜡菌、灵芝、云芝等的 SQS 蛋白聚为一支;不同碳氮源添加物培养基上的表达分析显示:果糖诱导该基因表达的能力最强, 而不同氮源添加物诱导该基因表达的能力无明显差异.关键词： 牛樟芝; 鲨烯合酶; 基因克隆; 表达分析; 作者简介：原晓龙 (1986-) , 男, 研究实习员, 研究方向为林木分子生物学收稿日期：2017-02-20基金：对外科技合作计划项目 (2015IA004) The Cloning and Expression Analysis of Squalene Synthetase Gene (AcSQS) in Antrodia camphorataYUAN Xiao
4、-long ZHAO Neng HUA Mei CHEN Jian YANG Yu-ming WANG Juan WANG Yi Key Laboratory for Conservation of Rare, Endanger Forestry College, Southwest Forestry University; Abstract： In order to understand the biosynthesis and regulation mechanism of the triterpene compounds in Antrodia camphorata, the SQS g
5、ene of Wolfiporia cocos ( AFR13032. 1) from Fomitopsidaceae fungi was used as template to isolate the Ac SQS gene from A. camphorata genome through the method of local Blast, we obaited the DNA sequence of squalene synthase gene ( Ac SQS) in A.camphorata. Then, we designed the special primers Ac SQS
6、F0 and Ac SQSR0 following the Ac SQS sequence, and got the full length of Ac SQS c DNA by PCR amplification. Nextly, we analyzed Ac SQS gene by bioinformatics, and detected its expression level growing in these medium that adding different carbon or nitrogen source. The results showed that the gene
7、we cloned is squalene synthase gene of A. camphorata ( Ac SQS) , which includes 4 extrons, 3 introns and 5-untransla-tional region, its opening reading frame has 1 803 bp, encoding 600 amino acids. Its amino acids lying from first to seventeenth place is the signal peptide site, which has 2 transmem
8、brane structure, could locate in the endoplasmic reticulum. The conserved proteinic sequence CHYVAGLVGEGLTRL locating in 189 204 of the domain and MGLMLQKTNIIRDY locating in 225 238 is the squelene synthetase characterized sites, DTIEDD and D ( Y/F) RED is the FPP binding sites.The results of Multip
9、le Em for Motif Elicitation showed that this protein could exist in the metabolism network of triterpene. The phylogenetic analysis revealed A. camphorata, Laetiporus sulphureus, Obba rivulosa, Ganoderma lucidum, Trametes versicolor, Trametes pubescens, Phlebia centrifuga, Moniliophthora roreri clus
10、tered one clan. The expression analysis in different carbon or nitrogen source clarified the induction ability of fructose is the best, and different nitrogen source has no significant effect on the ability of gene induction expression.Keyword： A; camphorata; squalene synthetase; gene cloning; expre
11、ssion analysis; Received： 2017-02-20牛樟芝 (Antrodia camphorata) 是我国台湾地区传统的珍稀食药两用真菌, 因野生牛樟芝子实体仅在腐朽、中空的牛樟树 (Cinnamomum kanehirai) 心材内壁寄生而得名1-2.牛樟芝属担子菌门 (Basidiomycota) 多孔菌目 (Polyporales) 多孔菌科 (Fomitopsidaceae) 薄孔菌属 (Antrodia) 真菌1,3.牛樟芝子实体中含有大量的三萜类活性物质, 具消炎抗过敏、抗氧化、降血糖血压、保肝护肝、抗肿瘤等生理活性, 亦可提高人体免疫力2,4-6, 牛樟芝
12、中的三萜类化合物对酒精引起的肝损伤疗效明显7.研究发现牛樟芝中三萜类化合物的合成途径与灵芝 (Ganoderm lucidum) 三萜合成途径相似;它们的三萜类化合物主要通过 MVA (mevalonate) 途径合成8-9.关于灵芝三萜类化合物合成的主要途径即 MVA 途径中关键酶、限速酶的克隆已有大量的报道10-13, 证明灵芝中鲨烯合酶 (squalene synthase, EC2.5.1.21, SQS) 是其三萜类化合物合成的关键酶.鲨烯合酶由 Agnew 等14于 1978 年首次从酵母中提取得到不稳定的酶, Sasiak等15于 1988 年从野生酿酒酵母中首次分离得到纯度 9
13、5%以上的 SQS 酶, 而其晶体结构到 20 世纪末被阐明16.Zhao 等10首次从灵芝中克隆得到 SQS 基因全长, 并通过酵母突变株互补实验确定其功能;SQS 酶催化 2 分子法呢基焦磷酸 (Farnesyl diphosphate, FPP) 缩合产生鲨烯 (Squalene) , 鲨烯是生物合成三萜、植物甾醇等萜烯类物质的共同前体17;而 FPP 在其他酶催化下也可产生赤霉素、类胡萝卜素等18.通过刺激 SQS 酶活性可显著调节生物体内植物甾醇和三萜类物质的含量:如正向诱导刺激刺五加 (Eleutherococcus senticosus) 19、人参 (Panax ginseng
14、) 20-21、灵芝10-22等体内 SQS 酶活性时, 其目的产物植物甾醇及三萜类物质含量明显上升.Lu 等8对牛樟芝 MVA 途径中的各种酶的作用和位置进行了报道, 尚未发现有关牛樟芝鲨烯合酶 (Ac SQS) 的报道.迄今为止, 从牛樟芝子实体中提取并鉴定结构的三萜类化合物多达 39 个, 这些三萜类化合物的骨架主要为麦角甾醇或羊毛甾烷型, 且其总三萜的含量高达63%2.国内外消费者之所以青睐牛樟芝, 因其体内三萜类物质含量较高且生理活性显著, 但牛樟芝子实体在人工和自然条件下生长极为缓慢23, 而使牛樟芝子实体显得尤为稀缺, 人工培养获得牛樟芝中的活性化合物难度大, 为有效解决这一困境
15、, 降低此类产品获得难度, 科研工作者进行了不同尝试, 已初步确定了影响牛樟芝三萜化合物产量的培养基配方及培养条件24-27.但对于不同培养基影响牛樟芝三萜类化合物产量方面的分子机理研究尚未见诸报道, 尤其是牛樟芝 SQS 酶在三萜类化合物代谢途径中的作用, 在基因水平上是如何调控三萜类化合物的生物合成, 目前尚不清楚.了解该基因分子机理的相关理论对于通过调节培养基、培养条件来提高三萜类化合物含量至关重要, 本文从基因水平出发, 对牛樟芝三萜类化合物 MVA 途径中的关键酶基因 Ac SQS 及不同培养基对其诱导表达影响等方面开展研究, 有利于更加深入地了解牛樟芝麦角甾醇及羊毛甾烷型三萜类化合
16、物的生物合成和调控机理, 为下一步研究和异源表达合成牛樟芝三萜类物质奠定基础.1 材料与方法1.1 实验材料牛樟芝菌丝体来自昆明市食用菌研究所, 编号为 AC001, 通过 ITS 及形态鉴定其为牛樟芝28, 以 Malt-Yeast 固体培养基 (Difco, Lawrence, USA) 为基质于恒温培养箱 25条件下进行扩繁.1.2 方法1.2.1 牛樟芝 Ac SQS 基因的分离与克隆用多孔菌科真菌茯苓 (Wolfiporia cocos, AFR13032.1) 的 SQS 基因的 DNA 序列为模板搜索牛樟芝基因组, 获得 Ac SQS 基因序列.用 RNA kit (康为世纪有限
17、公司) 提取牛樟芝菌丝体总 RNA, 并用反转录试剂盒 (Ta KaRa) 合成 c DNA;以分离得到的 Ac SQS 基因的 DNA 序列为基础, 用 DNA MAN 和 Primer 5.0 等生物信息学分析软件设计含有起始密码子和终止密码子的特异引物 Ac SQSF0 和Ac SQSR0 (表 1) ;以 c DNA 为模板, 以 Ac SQSF0 和 Ac SQSR0 为引物, 利用全式金 Hi Fi 高保真 DNA Taq 酶进行 PCR 扩增, 得到目的片段, 琼脂糖凝胶电泳后回收, 并将该 DNA 片段与克隆载体 p-GMT 连接转化, 用菌落 PCR 和酶切鉴定后将阳性克隆进
18、行测序.测序工作由上海生工生物工程有限公司完成.表 1 克隆反应过程中所用到的引物序列 Tab.1 The primers during the process of PCR amplification 下载原表 1.2.2 Ac SQS 基因及蛋白序列的生物信息学分析将阳性克隆测序结果用 DNA MAN 去除载体后, 通过 NCBI 上的 Blast 进行同源性比对, ORF Finder 推测该基因的开放阅读框;然后用蛋白质结构和功能预测工具对该基因蛋白序列的理化性质 (Prot Param) 、跨膜结构 (TMHMM Server v2.0) 、信号肽 (Signal P 4.1 ser
19、ver) 、蛋白质细胞定位 (Target P 1.1 server) 、保守基序预测 (MEME) 、蛋白质互作分析 (STRING) 等进行综合生物信息学分析 (表 2) .表 2 生物信息学在线程序及其网址 Tab.2 The online softwrae and their websites 下载原表 1.2.3 牛樟芝 Ac SQS 蛋白序列的分子系统进化分析选择 Gen Bank 上登录的茯苓 (Wolfiporia cocos AFR13032.1) 、硫磺多孔菌 (Laetiporus sulphureus KZT10188.1) 、拟蜡菌 (Obba rivulosa OC
20、H96268.1) 、灵芝 (Ganoderma lucidum ABF57213.1) 、云芝 (Trametes versicolor XP_008038533.1) 、绒毛栓菌 (Trametes pubescens OJT03258.1) 、离心射脉革菌 (Phlebia centrifuga OKY59978.1) 、异担孔菌 (Heterobasidion irregulare XP_009548849.1) 、毛韧革菌 (Stereum hirsutum XP_007311563.1) 、密褐褶孔菌 (Gloeophyllum trabeum XP_007864862.1) 、M
21、oniliophthora roreri XP_007852212.1、灰盖鬼伞菌 (Coprinopsis cinerea okayama XP_001831087.2) 、真姬菇 (Hypsizygus marmoreus KYQ35343.1) 、黑胶耳 (Exidia glandulosa KZV87498.1) 、皱木耳 (Auricularia subglabra XP_007340709.1) 、奇异裂孔菌 (Schizopora paradoxa KLO06719.1) 、桑黄 (Sanghuangporus baumii OCB89274.1) 和桦褐孔菌 (Inonotus
22、 obliquus AGA95493.1) 与牛樟芝 Ac SQS 蛋白序列, 用 MEGA 6.0 软件中的 Clustal W 程序进行序列比对, 选择 Neighbor-Joining 法 (邻位相接法) , 默认参数, 自展值 1 000, 对这些真菌的 SQS 蛋白序列进行聚类分析.1.2.4 牛樟芝 Ac SQS 基因在不同培养基上的表达分析根据项目组之前的研究27, 以表 3 中适合牛樟芝菌丝体迅速生长的 10 种培养基作为 Ac SQS 基因表达研究的培养基.并按照表 3 中的配方配制培养基, 将等量的牛樟芝菌丝体分别接种在 10 种培养基上, 在温度恒定为 25的培养箱中培养
23、 40 d 后, 各收获 0.5 g 牛樟芝菌丝体用于总 RNA 提取, 3 次重复;用反转录试剂盒 (康为世纪有限公司) 合成 c DNA, 以肌动蛋白 (actin) 为参照, 以TSQSF、TSQSR 特异引物 (表 1) 检测 Ac SQS 基因表达的具体情况.电泳结束后, 利用 GENE-SNAPS 图像分析软件分析目的条带的积分光密度并绘制柱状图, 对表达谱进行相对定量分析.表 3 10 种培养基配方 Tab.3 The formula of 10 medium 下载原表 2 结果与分析2.1 Ac SQS 基因的 c DNA 和蛋白序列分析利用特异引物 Ac SQSF0 和 Ac
24、 SQSR0 并以牛樟芝 c DNA 为模板扩增出一条长约1.8 kb 的基因片段, 将该片段连接到克隆载体上进行测序.用 DNA man 去除载体后的 DNA 序列经 Blast 比对分析, 结果表明, 该序列与茯苓 (AFR13032.1) 、栎迷孔菌 (KZT69243.1) 、硫磺多孔菌 (KZT10188.1) 等的鲨烯合酶基因序列具较高的一致性, 分别达 81%、80%和 78%.通过比对 Ac SQS 基因的 DNA 和 c DNA 序列发现 (图 1) , 该基因有 4 个外显子、3 个内含子 (1 5391 588、2 1972 247、2 3742434) 和 1 个 5-
25、非编码区 (1778) , 外显子拼接总长为 1 803 bp, 编码 600 个氨基酸;其蛋白序列分子质量为 57 680.34, 结构式为C2577H4030N702O744S29, 等电点 p I 6.31, 脂肪系数为 87.46, 其中 Leu (L) 、Ala (A) 、Arg (R) 为 Ac SQS 蛋白的主要氨基酸, 带负电荷的酸性氨基酸残基 (Asp+Glu) 共 64 个, 带正电荷的碱性氨基酸残基 (Arg+Lys) 共 60 个;该蛋白的不稳定系数为 47.22, 是一种不稳定蛋白.图 1 牛樟芝 ACSQS 基因中内含子和外显子的示意图 Fig.1 The sche
26、matic diagram of the intron and exon in Ac SQS gene of A.camphorata 下载原图2.2 Ac SQS 蛋白序列的生物信息学分析对 Ac SQS 蛋白序列进行信号肽、跨膜结构、细胞定位、保守基序及蛋白互作进行预测分析.信号肽预测显示该蛋白具有信号肽, 为 N 端的 117 为氨基酸残基;细胞定位显示其最可能位于细胞质中的内质网;跨膜结构分析显示该蛋白有两段跨膜结构, 分别位于蛋白序列的 313335 和 476498 位, 负责进出内质网;MEME (Multiple Em for Motif Elicitation) 软件分析该蛋
27、白的 5 条保守基序, 发现其含有 2 条保守基序 (motif 2 和 motif 3) 与鲨烯合酶结构域相关 (表 4) , 分别是位于该蛋白 189204 位的 CHYVAGLVGEGLTRL 和 225238 位的MGLMLQKTNIIRDY, DTIEDD 和 D (Y/F) RED 为法尼基焦磷酸 (Farnesyl diphosphate, FPP) 的绑定位点;用功能性蛋白关联网络在线分析软件 STRING分析牛樟芝鲨烯合酶在代谢通路中的位置及与其相关的酶, 预测结果显示 (图2) 与 Ac SQS 蛋白互作的酶有 10 个, 均与三萜和植物甾醇合成相关, 其中法尼基焦磷酸 (
28、Farnesyl diphosphate synthetase) 、法尼基转移酶 (Farnesyl transferase) 、十异戊二烯二磷酸合成酶亚单位 1 (Decaprenyl-diphosphate synthetase subunit 1) 、反式六异戊二烯基转移酶 (Trans-hexaprenyltranstransferase) 、羊毛甾醇 14-脱甲基酶 (Ianosterol 14-alpha-demethylase) 与 Ac SQS 在代谢途径中处于相邻位置.图 2 用 STRING 预测牛樟芝 Ac SQS 的互作搭档 Fig.2 Predicted intera
29、ction partners of Ac SQS protein by STRING server 下载原图(A) 蛋白互作网络显示与牛樟芝 SQS 的互作搭档; (B) STRING 标明网络中的通信和互作节点表 4 牛樟芝 5 个最保守蛋白基序 Tab.4 Five most conserved protein motifs in A.comphorata 下载原表 2.3 Ac SQS 蛋白的系统进化树的构建利用 MEGA 6.0 中的 Clustal W 程序对 Ac SQS 和其他 18 条真菌鲨烯合酶蛋白序列进行多序列比对后 (图 3) , 利用邻位相接法绘制分子系统进化树, 图
30、4 结果显示:这些真菌的鲨烯合酶蛋白序列分成 3 支, 其中牛樟芝和茯苓、硫磺多孔菌、拟蜡菌、灵芝、云芝、绒毛栓菌聚为一支;异担孔菌、毛韧革菌、密褐褶孔菌、灰盖鬼伞菌、真姬菇聚为一支;另黑胶耳、皱木耳、奇异裂孔菌、桑黄和褐褶孔菌聚为一支.牛樟芝的 SQS 与其同在多孔菌科的真菌 SQS 蛋白聚为一类, 与茯苓的亲缘关系最近, 说明牛樟芝 SQS 存在较高的保守性.图 3 牛樟芝 Ac SQS 与其他真菌 SQS 氨基酸序列比对分析 Fig.3 The alignment with Ac SQS in A.camphorata and oter fungal SQS proteinic sequ
31、ences 下载原图Dq:栎迷孔菌, Daedalea quercina, KZT69243.1;Ls:硫磺多孔菌, L.sulphureus, KZT10188.1;Or:拟蜡菌, O.rivulosa, OCH96268.1;Tv:云芝, T.versicolor, XP_008038533.1;Ac:牛樟芝, A.camphorata2.4 Ac SQS 基因在 10 种培养基上的诱导表达分析比较 Ac SQS 基因在添加不同碳氮源添加物的条件下的表达量, 结果显示:Ac SQS 基因在其他配方一致, 仅碳氮源添加物不同的情况下, 表达量差异较大.在碳源实验中 (图 5 (A) ) ,
32、葡萄糖和果糖可明显促进 Ac SQS 基因诱导表达, 显著提高其表达量;甘露醇、乳糖对 Ac SQS 基因的表达具抑制效应;比较其表达量, 果糖最高, 葡萄糖次之, 甘露醇的抑制能力最强, 乳糖次之.不同的氮源添加物诱导 Ac SQS 基因表达的能力相似, 其表达量牛肉浸粉最高, 土豆蛋白胨次之, 酵母提取物和胰蛋白胨的诱导表达能力相似, 酪蛋白胨的诱导表达能力最低.图 4 牛樟芝 Ac SQS 蛋白的系统进化分析 Fig.4 The phylogenetic tree of Ac SQS in A.camphorata 下载原图图 5 不同添加物对 Ac SQS 的诱导表达情况 Fig.5
33、The inducible expression of A.camphoratas Ac SQS gene cultivated in the MY basic medium of different carbon and nitrogen additives 下载原图3 讨论牛樟芝作为一种珍贵的食药两用真菌, 子实体内含有丰富的天然次生代谢产物, 多糖、三萜类化合物是牛樟芝子实体中最重要的生理活性物质2.鲨烯合酶是三萜类化合物生物合成的第一个关键酶, 催化 2 分子 FPP 以首尾连接的方式缩合生成鲨烯12.目前, 已从多种植物29-30和真菌10,14,31克隆得到 SQS基因.本研究通过
34、对牛樟芝 ACSQS 基因及蛋白的序列分析, 发现该蛋白含有鲨烯合酶的识别位点、富含天冬氨酸残基的 FPP 结合位点与其他多孔菌科真菌的SQS 蛋白序列显示出较高的一致性, 与其他真菌鲨烯合酶的特征性保守位点基本一致10,31;功能性蛋白关联网络分析显示该蛋白与鲨烯合成相关的酶处于相邻位置, 与 Robinson 等32的研究一致.系统进化分析结果显示牛樟芝 Ac SQS 蛋白与同在多孔菌科的真菌 SQS 亲缘关系较近, 而与黑胶耳、皱木耳等非多孔菌科的 SQS 亲缘关系相对较远, 与茯苓的亲缘关系最近, 该结论与 Zhao 等的研究结果一致10, 在某种程度上证实了真菌中的鲨烯合酶基因呈现集
35、中进化的趋势30-31, 不同的生物信息学分析方法从各角度证明了本研究中所克隆的基因是牛樟芝鲨烯合酶基因 (Ac SQS) .目前, 虽然已从不同植物、真菌中克隆得到大量的 SQS 基因, 但对其表达研究的报道较少, 尚未有不同培养基和培养条件对 SQS 基因表达影响的相关报道.本研究首次探讨牛樟芝鲨烯合酶基因Ac SQS 在不同的碳氮源下培养的表达情况, 通过比较不同碳氮源的表达水平发现, 在不同碳源添加物中果糖的表达量最高;与不同氮源进行比较, 发现所有氮源添加物的表达量均高于不同碳源实验中果糖的表达量;果糖能有效促进红色菌丝生长27, 考虑到一致性, 对不同碳氮源培养基配方进行适当处理,
36、 在进行不同氮源实验时使用果糖作为碳源, 其表达结果的数值差异正好佐证了果糖能够有效促进 Ac SQS 基因的诱导表达;对比碳源实验中果糖 (Fru) 及氮源实验的酵母提取物 (MYF2) 表达量, 其配方差异仅果糖浓度不同, 实际的表达量与果糖浓度呈正相关.不同碳氮源添加物和渗透压可影响真菌基因的诱导表达, 进而影响到次生代谢产物的生物合成, 这个结论已在其他基因及真菌的研究得到证实33-35, 同样在真菌萜类合成相关基因的诱导表达中亦有同样结论36, 采用 OMSAC (one strain, many cpmpounds) 策略可使同一基因在不同培养条件下诱导表达差异巨大.运用该策略能刺
37、激或激活不同基因或基因簇, 诱导其产生不同的次级代谢产物, 获得自然条件下得率较低或具新颖骨架和不同生理活性的化合物.Yuan 等37利用 OMSAC 策略从地衣内生菌 Myxotrichum sp.中成功得到 3 种聚酮类化合物 myxotritones A-C 和 1 种新的天然化合物 7, 8-dihydro-7R, 8S-dihydroxy-3, 7-dimethyl-2-benzopyran-6-one;Liu 等38采用 OMSAC策略从邬氏黄丝曲霉 (Talaromyces wortmannii) 中得到了wortmannilactones I1-I3 3 种具细胞毒性的新颖化合
38、物.目前, 有关牛樟芝三萜类合成酶的生物合成基因的功能研究较少, 本研究从牛樟芝基因组中分离并克隆得到鲨烯合酶 Ac SQS 基因全长, 并通过生物信息学对其蛋白序列进行预测和分析, 对该基因的功能及其相关信息进行预测, 同时利用 RT-PCR 检测不同碳氮源添加物对 Ac SQS 基因的表达的影响, 为进一步研究和探索牛樟芝三萜类化合物生物合成、异源表达提供必要前期数据和准备材料.参考文献1CHANG T T, CHOU W N.Antrodia cinnamomea sp.nov.on Cinnamomum kanehirai in TaiwanJ.Mycological Research
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