1、植 物 生 理 学 通 讯 , 一” 夕 。 夕 夕 “ ” 才 公 。 ”谷 氨 酸 合 酶 活 力 的 快 速 测 定郑 朝 峰 林 振 武中 国 科 学 院 上 海 植 物 生 理 研 究 所年 依 赖 铁 氧 还 蛋 白 的 谷 氨 酸 合 酶皿 , 的 发 现 证 明 植物 主 要 通 过 谷 氨 酞 胺 合 成 酶 谷 氨 酸 合 酶 途 径 进 行氨 的 同 化 。 在 这 个 氨 同 化 途 径 中 , 谷 氨 酸 合 酶 是 限速 酶 伽 , 主 】 , 它 催 化 一 分 子 谷 氨 酞 胺 和 一 分 子酮 戊 二 酸 形 成 两 分 子 的 谷 氨 酸 。 谷 氨 酸
2、合 酶 活 力 测定 的 关 键 是 如 何 把 产 物 谷 氨 酸 与 反 应 液 中 的 其 它 组分 , 尤 其 是 底 物 谷 氨 酞 胺 分 开 。 纸 层 析 、 纸 电 泳、 同 位 素 川 、 氨 基 酸 自 动 分 析 和 高 压 液 相 层 析等 技 术 都 曾 用 来 分 离 谷 氨 酸 , 但 作 为 常 规 测 定 都 不能 令 人 满 意 , 致 使 该 酶 的 研 究 一 直 未 能 广 泛 、 深 入地 开 展 。 最 近 国 外 用 离 子 交 换 树 脂 分 离 谷 氨 酸 取 得了 很 好 的 效 果 。 这 种 方 法 简 便 易 行 、 快 速 灵 敏
3、 、 可以 同 时 测 定 多 个 样 品 , 而 且 不 需 要 特 殊 设 备 , 这 些都 是 其 它 方 法 所 不 及 的 。 本 文 建 立 了 用 国 产 阴 离 子交 换 树 脂 分 离 谷 氨 酸 , 用 改 良 荀 三 酮 法 定 量 的 谷 氨酸 合 酶 活 力 测 定 技 术 , 比 文 献 报 道 的 方 法 灵 敏 度 高三 倍 多 , 操 作 也 更 简 便 。 现 将 该 法 作 一 介 绍 。活 力 。二 、 试 剂 与 材 料一 、 基 本 原 理不 同 氨 基 酸 在 同 一 下 所 带 的 净 电 荷 的 种 类和 数 量 不 同 。 在 一 范 围 内
4、 , 谷 氨 酞 胺 所 带 的净 电 荷 为 零 , 而 谷 氨 酸 带 负 电 荷 时 最 大 为一 。 当 含 反 应 底 物 谷 氨 酞 胺 和 产 物 谷 氨 酸 的酶 反 应 液 在 中 性 条 件 下 通 过 醋 酸 型 阴 离 子 交 换 树 脂柱 时 , 谷 氨 酞 胺 不 带 电 荷 , 不 能 被 树 脂 吸 附 , 用 蒸馏 水 即 可 将 它 从 柱 子 上 洗 脱 下 来 , 而 谷 氨 酸 带 负 电荷 与 树 脂 上 吸 附 的 醋 酸 根 离 子 相 互 置 换 而 被 吸 附 在柱 子 上 , 当 用 高 浓 度 的 醋 酸 洗 脱 时 它 又 被 醋 酸
5、根离 子 置 换 下 来 。 这 样 就 将 产 物 谷 氨 酸 与 反 应 物 谷 氨酞 胺 分 离 开 来 。 再 用 改 良 荀 三 酮 法 测 定 谷 氨 酸 量后 , 就 可 得 到 以 产 生 的 谷 氨 酸 量 表 示 的 谷 氨 酸 合 酶本 文 年 月 日 收 到今 本 工 作 在 汤 玉 玮 教 授 指 导 下 完 成 。 叶 济 宇 、 钱 露 萍和 赵 海 英 协 助 提 纯 铁 氧 还 蛋 白 , 邵 大 森 和 张 混 协 助 高 压 液相 分 析 , 谨 此 一 并 致 谢 。, 离 子 交 换 柱 制 备离 子 交 换 树 脂 处 理 及 再 生 阴 离 子 交
6、 换 树 脂 采用 “ 华 东 化 工 学 院 粉 末 型 强 酸 性 阴 离 子 交 换树 脂 万 华 东 化 工 学 院 树 脂 厂 。 商 品 树 脂 用 蒸馏 水 洗 一 次 以 除 去 水 溶 性 杂 质 及 细 小 颗 粒 , 抽 干后 依 次 用 处 理 小 时 , 蒸 馏 水 洗 至 中性 。 处 理 小 时 , 水 洗 至 中 性 , 醋 酸钠 处 理 小 时 , 再 用 醋 酸 洗 至 流 出 液 中 无一 为 止 用 检 验 最 后 用 水 洗 至 中 性备 用 。 使 用 过 的 树 脂 经 醋 酸 转 型 处 理 后 , 用 蒸 馏水 洗 至 中 性 还 可 重 新
7、使 用 。离 子 交 换 柱 的 制 备 层 析 柱 为 自 制 的 玻 璃 柱 ,即 在 内 径 为 。 的 滴 管 上 端 接 上 一 个 可 盛 一 毫升 溶 液 的 喇 叭 口 。 柱 底 用 少 许 脱 脂 药 棉 作 塞 子 , 将处 理 好 的 或 再 生 过 的 树 脂 与 水 混 合 “ , 吸取 注 入 层 析 柱 中 柱 高 , 待 水 流 千 后 即可 上 样 。提 取 级 冲 液 每 升 的 。 缓 冲 液 含 克 和 毫升 琉 基 乙 醉 。酶 反 应 液一 谷 氨 酞 胺一 酮 戊 二 酸铁 氧 还 蛋 白碳 酸 氢 钠连 二 亚 硫 酸 钠各 种 试 剂 均 用
8、 的 。 一 。 缓冲 液 配 制 并 调 至 。 用 甲 基 紫 精 作 电子 供 体 测 活 时 , 用 皿 甲 基 紫 精 代 替 铁 氧 还 蛋白 。 铁 氧 还 蛋 白 按 钱 露 萍 等 的 方 法 , 盆 从 菠 菜 叶 片中 提 纯 , 浓 度 用 处 的 克 分 子 消 光 系 数 为 。来 确 定 。布 三 翻 试 荆 按 。 五 等 的 方 法 配 制 。总 体 积 为 , 内 含 , 荀 三 酮 、 、 的 乙 醇 、 冰 醋 酸 、蒸 馏 水 。 这 样 配 制 的 苟 三 酮 试 剂 在 空 气 中 稳定 , 在 冰 箱 中 可 以 保 存 一 个 月 。石心叫三、
9、 谷 氨 酸 合 酶 的 提 取 及 活 力 测 定乃勺植 物 材 料 小 麦 呈 七 呈浙 麦 一 号 种 子 用 漂 白 粉 表 面 消 毒 分 钟 , 自 来水 浸 种 小 时 , 置 潮 湿 条 件 下 萌 动 小 时 , 然后 将 露 白 的 种 子 均 匀 地 摆 在 尼 龙 网 上 , 用 含 。硫 酸 钙 的 自 来 水 在 恒 温 室 培 养 , 光 强眺 的 提 取 将 培 养 夭 的 小 麦 苗 的 叶 片 剪下 , 放 低 温 冰 箱 中 一 冰 冻 若 干 小 时 后 剪 成 小段 , 放 在 预 冷 的 研 钵 中 加 少 量 石 英 砂 及 提 取 缓 冲 液研
10、磨 , 匀 浆 液 经 两 层 纱 布 过 滤 后 的 滤、液 , 。 。 。 离 心 分 钟 , 上 清 液 作 为 粗 酶 液 用 于 酶活 力 测 定 。 提 取 均 在 以 下 进 行 。醉 活 力 测 定操 作 步 骤 反 应 液 、 、 各 取 。 , 置, 。 水 浴 预 保 温 一 分 钟 , 再 加 。 粗 酶 液 , 最后 加 预 保 温 过 的 反 应 液 起 始 反 应 。 反 应 混合 液 总 体 积 毫 升 。 以 不 加 铁 氧 还 蛋 白 加 。 扭石 。 磷 酸 缓 冲 液 代 替 为 对 照 。 混 合 液 于 保温 分 钟 后 , 于 沸 水 浴 加 热
11、分 钟 , 再 剧 烈 摇 动几 分 钟 以 终 止 反 应 , 待 冷 后 用 。 将 调 至, 然 后 。 。 离 心 分 钟 。 上 清 液 及 洗 离 心管 的 水 全 部 上 离 子 交 换 柱 。 等 祥 品 全 部 进 入 柱 后 用二 水 , 。 醋 酸 依 次 洗 柱 子 , 洗 脱 浓 丢 弃 。 最 后用 醋 酸 洗 脱 吸 附 在 柱 子 上 的 谷 氨 酸 , 收 集全 部 洗 脱 液 , 直 接 加 色 茹 三 酮 试 剂 , 混 匀后 于 水 浴 保 温 分 钟 后 立 即 取 出 , 用 冰 水 迅 速冷 却 , 测 处 的 消 光 系 数 , 对 照 工 作
12、曲 线 求 出产 生 的 谷 氨 酸 的 量 。工 作 曲 线 用 标 准 谷 氨 酸 与 样 品 一 样 上 柱 、 洗 脱和 测 定 而 得 , 在 。 一 。 户 范 围 内 , 谷 氨 酸量 和 呈 很 好 的 线 性 关 系 。酶 活 力 单 位 用 时 每 克 鲜 重 组 织 或 每 毫 克蛋 白 每 分 钟 形 成 的 谷 氨 酸 的 微 克 分 子 数 来 表 示 。测 定 方 法 的 可 靠 性 及 灵 敏 度 对 分 部 收 集 的 洗脱 液 的 纸 层 析 结 果 和 测 定 分 析 图 、 表 明 反应 液 上 柱 后 用 水 可 将 谷 氨 酞 胺 全 部 洗 掉 ,
13、 这 在部 分 洗 脱 液 中 没 有 谷 氨 酸 , 随 后 用 醋 酸 可 以将 吸 附 的 谷 氨 酸 完 全 洗 脱 下 来 回 收 率 高 于并 且 只 有 谷 氨 酸 , 没 有 发 现 其 它 氨 基 酸 的 混 杂 。 由印 旅洗 脱 管 号图 阴 离 子 交 换 树 脂 醋 酸 型 对谷 氮 酸 合 酶 反 应 液 中 谷 氮 酥 脸 和 谷 奴 酸 的 分 离, 洗 脱 图 分 管 收 集 每 管分 管 收 集 洗 脱 液 的 纸 层 析 图展 开 剂 多 苯 酚 显 色 剂 多 布 三 酮 的 丙 酮 溶 液。 粗 酶 液 蛋 白 反 应 及 洗 脱 如 前 述于 将 洗
14、 脱 液 醋 酸 浓 度 由 等 人 的 提 高 到, 这 祥 所 用 洗 脱 液 的 量 减 少 。 另 外 , 对 也 醋 酸 洗脱 液 的 分 析 表 明 前 中 没 有 谷 氨 酸 , 因 此 本 方法 仅 收 集 后 醋 酸 洗 脱 液 , 这 样 的 处 理 比 较等 的 方 法 缩 短 了 洗 脱 时 间 , 收 集 的 洗 脱液 体 积 减 少 为 原 来 的 , 并 且 可 以 直 接 用 荀 三 酮试 剂 测 定 , 不 须 再 从 洗 脱 液 中 吸 取 少 盆 后 再 作 测 定 。这 样 使 该 法 的 灵 敏 度 大 大 提 高 为 等 的 方 法的 三 倍 多 ,
15、 只 要 反 应 中 形 成 的 谷 氨 酸 大 于 。 微克 分 子 就 可 以 测 定 。 本 法 所 用 荀 三 酮 试 剂 在 。和 醋 酸 溶 液 中 与 谷 氨 酸 的 显 色 直 相 同 表 。谷 氨 酸 合 酶 测 定 系 统 中 谷 氨 酸 的 产 生 依 赖 于 该酶 的 底 物 一 谷 氨 酸 胺 、 一 酮 戊 二 酸 和 铁 氧 还 蛋 白 ,这 些 因 素 缺 一 不 可 。 虽 然 当 反 应 系 统 中 不 加 底 物 或电 子 供 体 时 也 有 少 量 谷 氨 酸 形 成 , 但 这 是 一 种 干 扰 ,仅 为 全 反 应 液 的 一 表 。 这 主 要
16、是 因 为 测 定时 用 的 是 酶 的 粗 提 取 液 , 其 中 可 能 有 谷 氨 酞 胺 酶 ,裹 醋 酸 浓 度 对 苟 三 酮 显 色 反 应 的 影 晌群 谷 氮 酸 奄 升二 。三翻场冲了 三 竺 竺 竺 兰 一一 。 表 小 麦 叶 片 谷 氮 酸 合 酶 活 力 对 底 物 及电 子 供 体 的 依 赖反 应 系 统全 反 应 液一 谷 氨 酸 胺一 一 酮 戊 二 酸一 谷 氨 酞 胺 一 酮 戊 二 酸一 铁 氧 还 蛋 白一 连 二 亚 硫 酸 钠一 酶酶 活 力 厂厂时 分 钟图 谷 氨 醛 合 醉 活 力 和 反 应 时 间 的 关 系谷 氨 酸 脱 氢 酶 和
17、谷 氨 酞 胺 转 氨 酶 等 酶 类 , 天 门 冬 氨酸 、 天 然 底 物 及 铁 氧 还 蛋 白 等 因 子 , 这 些 都 会 干 扰酶 活 力 的 测 定 。 这 些 干 扰 因 素 的 千 扰 程 度 因 材 料 而异 。还 原 态 的 甲 基 紫 精 也 可 以 作 为 小 麦 叶 片 谷 氨 酸合 酶 的 电 子 供 体 , 但 其 活 力 仅 为 用 铁 氧 还 蛋 白 时 的一 表 。 但 不 论 用 哪 种 电 子 供 体 , 用 本 法测 定 的 酶 活 力 都 与 酶 活 力 成 正 比 表 。表 谷 氮 酸 合 酶 与 谷 氮 酸 生 成 一 的 关 系单 位 拼
18、遏时 间 分 钟图 苟 三 酮 反 应 时 间 对 显 色 值 的 影 晌, 召 醋 酸铁 氧 还 蛋 白甲 基 紫 精 丽。 ,当 加 入 。 粗 酶 液 蛋 白 时 , 酶 活 力在 最 初 分 钟 内 形 成 。 一 。 产 谷 氨 酸 与反 应 时 间 呈 线 性 关 系 。 以 后 酶 活 力 的 增 加 渐 趋 平 缓图 。 同 一 样 品 三 次 重 复 间 的 相 对 误 差 三为 。测 定 中 应 注 意 的 问 题荀 三 酮 反 应 完 毕 后 , 一 定 要 将 试 管 立 即 用冰 水 冷 却 , 以 精 确 控 制 反 应 时 间 , 因 为 反 应 时 间 过长 或
19、 过 短 都 会 减 少 稳 定 化 合 物 的 形 成 图 。用 更 灵 敏 的 高 压 液 相 层 析 对 上 往 后 分 部 收集 的 洗 脱 液 进 行 鉴 定 , 在 的 水 洗 脱 液 中 没 有 发现 谷 氨 酸 , 在 醋 酸 洗 脱 液 中 仅 发 现 有 微 量 的天 门 冬 氨 酸 一 的 混 杂 , 但 这 样 微 量 的 天 门 冬氨 酸 一 般 不 影 响 测 定 。 如 果 某 种 材 料 的 粗 酶 液 中 天门 冬 氨 酸 含 量 很 高 , 可 参 照 。 五 的 方 法 消 除 它对 测 定 的 影 响 。 , 一 氨 基 丁 酸 也 是 一 种 不 易
20、与 谷 氨酸 分 开 的 物 质 , 需 用 一 柱 将 共 与谷 氨 酸 分 开 , 但 在 本 测 定 中 未 发 现 这 一 氨 基 酸 的混 杂 。要 掌 握 好 、 一 和 等 阴 离 子 的浓 度 , 这 些 离 子 对 谷 氨 酸 在 柱 子 上 的 滞 留 都 有 影 响 。 本 文 所 用 往 子 最 多 可 吸 附 拼 谷 氨 酸 。在 换 算 酶 活 力 单 位 时 , 应 将 实 验 所 得 数 据除 以 , 因 为 在 谷 氨 酸 合 酶 催 化 的 反 应 中 形 成 了 两分 子 相 同 的 谷 氨 酸 。参 考 文 献钱 月 琴 等 , , 植 物 生 理 学
21、通 讯 连 一钱 露 萍 等 , 植 物 生 理 学 报 一一 , , 一一 一 。止 , , ,卜 , 一, , , , “ 五 口一口 , , “ 而, , , , 一, , , 一一 。, , , ,一 。, , 外 , 一, , 址 ,一盯 。 盆 , , ,一, , , , , 一,曰二咭几井 田 正 二 , ,计 , 透 一三 , , , 玲 ,一了 了 , 。 了 , , 一 一 一, , 召 , 通 一。, , , 台 ” ,一 。比 一 , , , , 址 孙 了 , 一 奋 。忿 , , , “ ,一 。二 一 , , , , 一, , , , 一加 , , , , , “
22、 乳 五 饱, , 过 ,工 月胜斑印 吕曰,占 尸 ,工 胜 工翻闷上均二护 尸 上 海 农 业 学 报 征 稿 、 征 订 启 事 上 海 农 业 学 报 是 上 海 市 农 学 会 和 上 海 市 农 业 科 学 院 联 合 主 办 的 农 业 综 合 性 学 术 刊 物 。它 的 任 务 是 重 点 反 映 上 海 市 农 业 科 研 、 教 学 方 面 的 新 成 就 , 开 展 国 内 外 学 术 交 流 , 为 繁 荣 农业 科 教 事 业 , 加 快 农 业 现 代 化 步 伐 服 务 。 读 者 对 象 , 主 要 是 农 业 科 教 和 技 术 、 管 理 工 作 者 及领
23、 导 机 关 的 有 关 专 业 人 员 。 上 海 农 业 学 报 主 要 反 映 上 海 的 农 业 自 然 资 源 、 农 学 、 园 艺 花 卉 、 食 用 真 菌 、 畜 牧 兽 医 、农 业 物 理 、 农 用 电 脑 、 土 坡 农 化 、 植 物 病 虫 草 害 及 其 防 治 、 农 业 环 境 、 农 业 生 态 、 农 业 机 械 、农 业 气 象 、 农 业 能 源 、 土 地 利 用 、 农 田 水 利 、 农 业 经 济 和 乡 镇 建 设 等 应 用 研 究 以 及 农 业 生 物工 程 、 农 业 生 物 遗 传 、 生 理 、 生 化 应 用 基 础 研 究
24、方 面 具 有 创 造 性 的 , 代 表 上 海 农 业 科 教 水 平的 重 要 研 究 成 果 和 学 术 论 文 。 上 海 农 业 学 报 为 季 刊 , 每 季 中 月 日 出 版 。 每 期 开 一 页 , 暂 定 价 元 , 全 年四 期 共 元 。 欲 订 阅 者 可 从 速 通 过 邮 局 或 银 行 信 汇 平 寄 邮 资 在 内 , 如 需 挂 号 全 年 另 加 。元 至 本 刊 编 辑 部 。 银 行 帐 号 上 海 市 农 业 科 学 院 情 报 研 究 所 人 行 北 新 径 办 事 处 。 发票 随 刊 奉 寄 。来 稿 请 寄 上 海 市 北 翟 路 号 上 海 市 农 业 科 学 院 科 技 情 报 研 究 所 上 海 农 业 学 报 编 辑部 。欢 迎 订 阅 欢 迎 投 稿 上 辑 农 业 学 报 编 辑 部
