1、 培养前后脐血 CD34+细胞在 NOD/SCID 鼠体内造血重建功能的比较作者：杨施, 蔡海波, 金慧丽, 谭文松【摘要】 目的: 以 NOD/SCID 小鼠为模型 , 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞, 以比较培养前后脐血 CD34+细胞的造血重建功能。方法: 从新鲜脐血中分离单个核细胞（MNC）, 采用干细胞因子（SCF）、 血小板生成素（ TPO）、 Flt3 配体（FL）、 白细胞介素 3（IL3）和白细胞介素 6（IL6）细胞因子组合体外培养 14 d。通过 MiniMACS 免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的 MNC 中分离 CD34+细胞, 4105 个 CD34+细胞
2、和5106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入 NOD/SCID 小鼠中。饲养过程中动态观察外周血象恢复情况, 6 周后检测小鼠骨髓和脾脏细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量。结果: 体外培养 MNC 14 d 后, 总细胞扩增了 1.78 倍; 细胞移植 6 周后, 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活, 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异 ALU 基因序列, 小鼠外周血象恢复到辐照前水平。培养后 CD34+细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜 CD34+细胞的相近, 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜 CD34+细胞。 结论: 体外培养 14 d 后的 CD34+细胞仍保持
3、了体内植入和重建造血的能力, 且其多系造血重建能力优于新鲜 CD34+细胞。 【关键词】 CD34+细胞; 造血重建; NOD/SCID 小鼠Abstract AIM: To study the hematopoietic reconstitution ability of fresh and cultured cord blood CD34+ cells by sublethally irradiated NOD/SCID mice. METHODS: Mononuclear cells (MNC) were separated from cord blood and then cultur
4、ed with stem cell factor (SCF)+ flt3 ligand (FL)+thrombopoietin (TPO)+ interleukin3 (IL3)+ IL6 for 14 d. CD34+ cells were isolated from fresh or cultured MNC using miniMACS magnetic separation system. Then 4105 CD34+ cells together with 5106 CD34- cells were injected into NOD/SCID mice. After transp
5、lantation, the dynamics of hematopoieitc recovery in the mice were measured. After 6 weeks, bone marrow (BM) and spleen samples were obtained from mice for detecting human cells. RESULTS: The number of total cells increased 1.78fold after 14 d of culture. All recipients received fresh and cultured C
6、D34+ cells survived. Human cells, human lineage cells and human ALU sequence could be detected in BM and spleen. The peripheral blood counts of all transplanted mice recovered. The engraftment levels of cultured CD34+ cells were similar to those of fresh CD34+cells but the percentage of human lineag
7、e cells was higher than that of fresh CD34+ cells. CONCLUSION: CD34+ cells cultured for 14 d still preserved the hematopoietic reconstitution ability and showed better multilineage reconstitution ability than fresh CD34+ cells.KeywordsCD34+ cells; hematopoietic reconstitution; NOD/SCID mice摘 要 目的: 以
8、 NOD/SCID 小鼠为模型, 经半致死剂量照射后输注新鲜或培养后的造血细胞, 以比较培养前后脐血 CD34+细胞的造血重建功能。方法: 从新鲜脐血中分离单个核细胞（MNC）, 采用干细胞因子（SCF）、 血小板生成素（ TPO）、 Flt3 配体（FL）、 白细胞介素 3（IL3）和白细胞介素 6（IL6）细胞因子组合体外培养 14 d。通过 MiniMACS 免疫磁性吸附柱从新鲜或培养后的 MNC 中分离 CD34+细胞, 4105 个 CD34+细胞和5106CD34-细胞混合后通过尾静脉输注入 NOD/SCID 小鼠中。饲养过程中动态观察外周血象恢复情况, 6 周后检测小鼠骨髓和脾脏
9、细胞中人源细胞及各系造血细胞的含量。结果: 体外培养 MNC 14 d 后, 总细胞扩增了 1.78 倍; 细胞移植 6 周后, 输注新鲜和培养后造血细胞的小鼠均存活, 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源细胞及各系人源血细胞和人特异 ALU 基因序列, 小鼠外周血象恢复到辐照前水平。培养后 CD34+细胞在小鼠体内的植入水平与新鲜 CD34+细胞的相近, 而其各系人源血细胞的含量高于新鲜 CD34+细胞。 结论: 体外培养 14 d 后的 CD34+细胞仍保持了体内植入和重建造血的能力, 且其多系造血重建能力优于新鲜 CD34+细胞。关键词CD34+细胞; 造血重建; NOD/SCID 小鼠脐血
10、作为一种造血干/祖细胞的来源具备采集方便、 GVHD 发生率低等许多优势, 但是由于单份脐血所含的造血干/ 祖细胞的绝对数量有限, 限制了其在临床上的应用, 采用体外扩增技术可以解决这一瓶颈1。然而, 对体外扩增后的造血干/ 祖细胞能否保持其生理功能还存在许多争议。Astori 等2采用 Dideco “Pluricell System”扩增脐血 CD34+细胞, 发现其在 NOD/SCID 小鼠体内的植入水平明显高于新鲜脐血 CD34+细胞。而 Xu 等3却报道 , 经 SCF、 IL6、 FL 和巨核细胞生长发育因子(megakaryocyte growth and development
11、 factor, MGDF)培养 14 d 的脐血 CD34+细胞, 其植入水平明显低于新鲜 CD34+细胞。NOD/SCID 小鼠是一种先天免疫缺陷的动物模型, 能够支持异基因造血干/祖细胞的植入和生长, 被广泛应用于造血干/祖细胞的研究中。我们以 NOD/SCID 小鼠作为移植模型, 比较培养前后的 CD34+细胞的造血重建功能 , 为扩增后脐血造血干/祖细胞应用于临床提供了有益试验结果。1 材料和方法1.1 材料 实验小鼠采用 68 周龄 NOD/SCID 小鼠, 由中国科学院上海实验动物中心提供; 脐血由上海国际和平妇幼保健院提供; 淋巴细胞分离液为上海华精公司产品; MiniMACS
12、 免疫磁性吸附柱分离装置和 CD34+细胞选择试剂盒均购自德国 Miltenyi Biotec GmbH 公司; 体外培养基本培养基 IMDM 购自 Gibco 公司, 胎牛血清为美国Hyclone 公司产品, 2 巯基乙醇为 Sigma 公司产品 ; 所有细胞因子均购自美国 Peprotech 公司; 流式检测中所用抗体均为法国 Immunotech产品; 流式细胞分析仪(FACS Caibur)购自 BD 公司; 基因组 DNA 提取试剂盒购自天根公司。1.2 方法1.2.1 脐血单个核细胞（MNC ）的分离 脐血经淋巴细胞分离液密度梯度离心后, 收集 MNC, 洗涤 2 次后备用。新鲜分
13、离和培养 14 d的 MNC, 采用 MiniMACS 免疫磁性吸附柱分离装置 , 按照 CD34+细胞选择试剂盒说明书进行操作即获得纯化的 CD34+细胞。1.2.2 脐血单个核细胞体外培养 体外培养基采用 IMDM, 使用时添加 200 mL/L 胎牛血清和 510-5 mol/L 2巯基乙醇。采用细胞因子组合为 SCF+FL+TPO+IL6+IL3, 其浓度分别为 50、 50、 20、 20 和 5 g/L。MNC 以 1109/L 的密度接种于 24 孔板, 每孔培养体积为 2 mL, 每周半量稀释换液 2 次。细胞培养在 37、 体积分数为 50 mL/L CO2 及饱和湿度的培养
14、箱中进行。培养 14 d 后收获细胞, 分离 CD34+和 CD34-细胞。1.2.3 细胞计数 总细胞采用血球计数板计数。检测总细胞中CD34+细胞百分含量时, 用 PE 标记的小鼠抗人 CD34 抗体标记总细胞, 用流式细胞术分析。 CD34+细胞的绝对数量采用如下公式: CD34+细胞的绝对数量总细胞个数CD34+细胞百分含量。1.2.4 小鼠移植实验 细胞移植前, 对小鼠进行 2.7 Gy 亚致死剂量的 137Cs 射线照射。实验小鼠共分 3 组: (1)对照组: 不输注任何细胞; (2)未培养细胞组: 输注 4105 个新鲜 CD34+细胞和 5106CD34-细胞; (3)培养后细
15、胞组: 输注 4105 个培养 14 d 的 CD34+细胞和5106 个 CD34-细胞。移植时, 将待输入 CD34+细胞和 CD34-细胞混合后悬浮于 0.3 mL 的 IMDM 中, 经尾静脉注射输入小鼠体内。饲养 6 周后, 将小鼠颈脱臼处死, 获取骨髓和脾脏细胞进行人源细胞含量分析。1.2.5 小鼠外周血象分析和细胞表型分析 小鼠外周血采集分别在移植前、 移植后第 7 天、 28 天和第 42 天进行, 每次由眼眶采血50 L, 进行外周血象分析。标抗体前, 先裂解红细胞, 然后用 FITC标记的小鼠抗人 CD45 抗体、 PE 标记的小鼠抗人 CD3 抗体、 小鼠抗人 CD19
16、抗体、 小鼠抗人 CD33 抗体、 小鼠抗人 CD34 抗体和小鼠抗人 CD71 抗体标记细胞以分析以人源各系细胞的含量。标好抗体的细胞 4孵育 30 min 之后用 PBS 洗 2 遍, 离心后, 每管加0.5 mL 抗体保存液。标记细胞用流式细胞术分析, 结果用 CellQuest软件处理。1.2.6 人源 ALU 序列检测 抽提小鼠骨髓和脾脏细胞中的 DNA, 提取时按照基因组 DNA 提取试剂盒进行操作。阴性对照为NOD/SCID 小鼠细胞基因组 DNA, 阳性对照为人外周血白细胞基因组 DNA, 实验组分别为未培养细胞组和培养后细胞组小鼠骨髓和脾脏细胞基因组 DNA。ALU 序列引物
17、正义链为5CACCTGTAATCCCAGCAGTTT3, 反义链为 5CGC GATCTCGGCTCACTGCA3, 扩增片段长 221 bp。反应参数为: 94预热 4 min, 94变性 1 min, 55退火 45 s, 72延伸 1 min, 共21 个循环, 72补齐延伸 5 min, 扩增片段长为 221 bp, PCR 产物用20 g/L 的琼脂糖分离, 用溴化乙锭染色后观察。1.2.7 统计学分析 实验数据以 xs 表示, 采用 SPSS 统计软件作Students t 检验, P0.05 表示有统计学意义。 2 结果2.1 造血细胞的体外扩增 MNC 培养 14 d 后, 总
18、细胞扩增倍数为1.78 倍, 而 CD34+细胞数量没有增加。2.2 NOD/SCID 小鼠的存活状况 对照组 4 只小鼠照射后出现萎靡、倒毛的症状, 并在 2 周内相继死亡, 而未培养细胞组 4 只小鼠和培养后细胞组 4 只小鼠全部存活。2.3 扩增造血细胞在 NOD/SCID 小鼠体内的植入情况 移植细胞6 周后, 在存活小鼠的骨髓和脾脏中均可检测到 CD45+CD34+细胞, 说明输注的人 CD34+细胞已植入小鼠中。输注培养后 CD34+细胞组小鼠的骨髓和脾脏中 CD45+CD34+细胞的平均含量分别为 28.49%和 10.81%, 输注新鲜 CD34+细胞组的小鼠的为 24.48%
19、和 9.09%, 两组之间无统计学意义（P0.05）。该结果表明, 培养后 CD34+细胞的植入能力与新鲜的 CD34+细胞相近。进一步采用 PCR 法检测了小鼠骨髓和脾脏细胞中人源特异的 ALU 序列, 从分子水平验证人CD34+细胞在小鼠中的植入。作为阴性对照组的 NOD/SCID 小鼠中没有检测到人源 ALU 序列, 而在经半致死剂量放射照射后输注了新鲜或培养后的 CD34+细胞的小鼠中均检测到了 ALU 序列( 图 1), 表明人源细胞已经成功植入小鼠体内。2.4 扩增造血细胞在 NOD/SCID 小鼠体内多系造血重建能力检测 在存活小鼠的骨髓和脾脏中均检测到 CD45+CD3+细胞（
20、T 细胞）、 CD45+ CD19+细胞（B 细胞）、 CD45+ CD33+细胞（髓系细胞）和 CD45+CD71+细胞（红系细胞）。培养后细胞组小鼠骨髓中的各系细胞平均含量都较未培养细胞组高, 且 T 细胞、 B 细胞和红系细胞的平均含量都显著高于未培养细胞组（P0.05, 表 1）; 同样, 培养后细胞组小鼠脾脏中的各系细胞平均含量都显著高于未培养细胞组（P0.05, 表 2）。上述结果表明, 培养后 CD34+细胞的多系重建造血能力优于新鲜 CD34+细胞。表 1 NOD/SCID 小鼠骨髓内人源细胞各系抗原表达表 2 NOD/SCID 小鼠脾脏内人源细胞各系抗原表达2.5 NOD/S
21、CID 小鼠外周血象分析 为了动态观察移植后NOD/SCID 鼠的造血恢复情况, 检测了实验小鼠在照射前（0 d）以及照射后第 7 天、 28 天和第 42 天时外周血中白细胞（WBC）、 红细胞（RBC）和血小板（PLT）的含量（表 3）。可以看出, 受半致死剂量照射的影响, 在移植后第 7 天, NOD/SCID 小鼠外周血中的WBC、 RBC 和 PLT 的数量均较照射前减少 , 其中 WBC 和 PLT 对照射较为敏感, 数量急剧下降。与未培养细胞组相似, 培养后细胞组小鼠外周血象各项参数在照射 7 d 后开始回升, 到 42 d 时基本恢复到照射前水平, 说明所植入的培养后的 CD3
22、4+细胞也有助于小鼠的造血恢复。表 3 移植后小鼠外周血象恢复情况3 讨论目前对于造血干细胞体外扩增后能否维持其正常的生理功能尚存在争议。Piacibello 等4报道在 FL+MGDFSCFIL6 体系中扩增 410 周后的脐血 CD34+细胞的移植水平远远高于移植了相同数量的新鲜细胞的小鼠。Guenechea 等5却认为扩增后的脐血CD34+细胞与新鲜的相比, 短期植入明显延迟。因此 , 体外培养对脐血 CD34+细胞生理功能的影响有待进一步研究。我们采用 SCF+ TPO + FL + IL3+ IL 6 细胞因子组合培养脐血MNC 14 d, 以 NOD/SCID 小鼠作为移植模型,
23、比较了培养前后的脐血 CD34+细胞的造血重建功能。移植 6 周后, 在小鼠骨髓和脾脏中均可检测到人源 CD45CD34+ 细胞, 经 PCR 验证在小鼠骨髓和脾脏的 DNA 中均存在人源 ALU 序列; 同时, 在小鼠体内均检测到人源 T 细胞、 B 细胞、 髓系细胞和红系细胞 , 表明新鲜和培养后的CD34+细胞都可以植入 NOD/SCID 小鼠中, 并且向各系分化。外周血象分析结果表明, 未培养细胞组和培养后细胞组小鼠, 在照后 6 周外周血象各项参数基本恢复到照前水平, 说明新鲜和培养后的CD34+细胞都有助于小鼠造血恢复。此外, 分析移植细胞在小鼠体内向各系细胞分化发现, 培养后 CD34+细胞的多系重建造血能力优于新鲜 CD34+细胞, 这可能是因为在体外培养过程中 , 造血前体细胞数量增多, 并且产生了一些有利于植入的特定细胞6。总之, 与新鲜 CD34+细胞相同, 体外培养 14 d 后的 CD34+细胞可以成功植入 NOD/SCID 小鼠体内, 实现各系造血重建, 促进小鼠的外周血象恢复正常, 且体外培养 14 d 后, CD34+细胞的植入能力与新鲜的 CD34+细胞相近, 且其多系造血重建能力优于新鲜的 CD34+细胞。【
