1、CdTe/CdSSiO2BPEI-CQDs 双发射比率荧光探针的构建及在测定生物样品中 Cu () 的应用 俱玉云 陈永雷 陈兴国 兰州大学化学化工学院 摘 要： 本文制备了对 Cu () 具有选择性识别作用的 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 双发射比率荧光探针。基于 Cu () 能使探针表面的 BPEI-CQDs 荧光猝灭的现象, 建立了测定 Cu () 的比率荧光新方法。在最佳条件下, 该方法测定 Cu () 的线性范围为 0.4070mol/L, 检测限为 0.27mol/L。建立的方法已被成功用于人体尿液及血浆中 Cu () 的测定。关键词： Cu () ; 双发射比
2、率荧光探针; 碳量子点; 作者简介：陈兴国, 男, 博士, 教授, 从事生命分析化学、高效毛细管电泳、纳米材料在分析化学中的应用等研究工作.E-mail:收稿日期：2017-04-15基金：国家自然科学基金 (No.21375053, 21675068) Preparation of Double Emission Ratio Fluorescence Probe Cd Te/Cd S Si O2 BPEI-CQDs and the Application in the Determination of Cu ( ) in Biological SamplesJU Yu-yun CHEN Yo
3、ng-lei CHEN Xing-guo Department of Chemistry, Lanzhou University; Abstract： In this paper, a double emission ratio fluorescence probe, Cd Te/Cd S Si O2 BPEI-CQDs, was prepared.The fluorescence method for the determination of Cu ( ) was established using Cd Te/Cds-Si O2BPEI-CQDs as the probe.Under th
4、e optimum conditions, a good linear relationship was obtained from 0.40 to 70mol/L with a limit of detection of 0.27 mo/L.Furthermore, the method has succeeded in detecting Cu ( ) in urine samples and human blood plasma samples.Keyword： Cu () ; Double emission ratio fluorescence probe; CQDs; Receive
5、d： 2017-04-15Cu () 的重要作用之一是作为很多生理反应中酶的辅因子以及威尔森氏病、阿兹海默症等疾病的诊断标准1。然而, Cu () 浓度较高时会导致婴儿肝损伤及儿童肝硬化等, 对人体健康具有危害性2。随着铜在工业中的广泛使用, 铜含量对人类健康的影响及其测定方法引起了人们越来越多的关注3-5。目前, 测定 Cu () 的方法主要有原子吸收光谱、电感耦合等离子体原子发射光谱、电化学等方法6。近年来, 荧光化学传感器由于其高灵敏度、高选择性、操作简单等优点日益受到人们关注。然而, 大多数荧光化学传感器的荧光强度虽然会随着 Cu () 浓度的变化增强或减弱, 但这种单一的以强度变化测
6、定 Cu () 的方法通常会受到传感器浓度 (物质) 、检测器或光源的稳定性、复杂样品基质中共存组分等的干扰或者影响。双发射比率荧光方法通过比率荧光来检测目标物则可避免上述问题的影响7-8。然而受限于不同种类的荧光类物质的寻找及设计, 该类探针的报道相对较少。近年来, 碳量子点 (CQDs) 由于其良好的水溶性、光稳定性、生物相容性、低毒性等优点备受人们瞩目9-11。虽然CQDs 由于具备分子识别作用而被用于化学传感器12-18, 但是将 CQDs 用于比率荧光探针的构建, 并进一步用于生物样品检测方面的研究仍相对较少。与有机荧光类物质相比, CQDs 用于比率荧光探针的构建不需要复杂的合成过
7、程。Zhou 等8提出了基于 CQDs 为荧光输出信号的双发射荧光探针测定 Cu () , 但该 CQDs 对 Cu () 没有识别作用, 所以需要修饰一种对 Cu () 有识别作用的有机分子, 导致制备过程复杂。本文通过一锅法制备了 Cd S 掺杂的 Cd Te 红光量子点 (Cd Te/Cd S) 19, 通过柠檬酸和聚乙烯亚胺 (BPEI) 热裂解制备了蓝光 CQDs12。利用硅酸乙酯水解制备 Si O2微球并将 Cd Te/Cd S 包裹在该 Si O2球内20, 进一步将上述蓝光 CQDs 连接在 Si O2球表面, 成功制备了双发射比率荧光探针 (Cd Te/Cd S-BPEI-C
8、QDs) , 并将其用于检测人体尿液及血浆中的 Cu () 。该探针检测 Cu () 的原理见图 1。1 实验部分1.1 仪器和试剂所制备的样品形貌及尺寸由 Hitachi-6000 透射电子显微镜 (TEM) (日本, 日立) 进行表征。傅里叶变换红外光谱 (FT-IR) 通过 Nicolet Nexus 670 傅里叶变换红外光谱仪来测定。RF-5301PC 荧光光谱仪 (日本, 岛津) 用于测定体系的荧光光谱, 激发波长为 365 nm, 激发和发射的狭缝宽度均为 5 nm。图 1 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 检测 Cu () 的原理 Fig.1 Schematic
9、 Illustration of the Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs for Sensing of Cu () 下载原图巯基丙酸 (MPA) 、Na BH 4、聚乙烯亚胺 (BPEI) 购于百灵威试剂公司。Cd Cl2、Na 2Te O3、Na OH、硅酸乙酯、柠檬酸钠均购自天津光复精细化工研究所, 实验所用试剂均为分析纯。AXLM 1820-V AXL 净水器用于制备超纯水。1.2 Cd Te/Cd S 红光量子点的合成将 74L 的 MPA 加入至 100 m L Cd Cl2溶液中 (0.5 mmol) 并搅拌混匀。将 20 mg 柠檬酸钠加入该混合溶液中, 搅拌
10、10 min 后, 用 0.1 mol/L Na OH 调节溶液 p H 为 11.2, 加入 4.4 mg Na2Te O3及 20 mg Na BH4、搅拌至溶解完全并缓慢加热到 90, 冷却至室温并用乙醇离心反复洗涤, 将下层固体分散于 5 m L乙醇中, 备用。1.3 Cd Te/Cd SSi O2的合成移取 2 m L Cd Te/Cd S 量子点溶液分散于 100 m L 水和乙醇混合液中 (水乙醇=14) , 超声至分散均匀。40下加入 4.6 m L 浓氨水、460L 硅酸乙酯, 恒温加热 3 h。冷却后离心分离, 用乙醇和水交替洗涤, 得到肉粉色的 Cd Te/Cd SSi
11、O2, 自然晾干后, 备用。1.4 BPEI-CQDs 的合成将 0.5 g 聚乙烯亚胺及 1.0 g 柠檬酸溶解于含有 10 m L 超纯水的 25 m L 烧杯中, 慢慢加热至接近 200, 恒温 20 min 使溶液的颜色变为淡黄色, 继续加入1 m L 超纯水, 重复操作 10 次, 溶液颜色变为橘黄色时表明形成了 BPEI-CQDs。用超纯水稀释至 10 m L, 0.01 mol/L 盐酸过柱纯化。将得到的 BPEI-CQDs 溶液减压蒸馏, 得到胶状 BPEI-CQDs, 于真空干燥箱 40烘干12。1.5 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 的合成将 0.12 g
12、 Cd Te/Cd SSi O2溶解于 120 m L 乙醇中, 加入 25.5 mg BPEI-CQDs至上述溶液中, 加热至 60, 加入 225L 硅酸乙酯及 225L 异腈酸酯, 60恒温 6 h。冷却后离心, 将所得固体用乙醇和超纯水交替洗后, 自然晾干得到Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs。1.6 Cu () 的测定方法依次加入 2.47 m L 10 mmol/L 磷酸盐缓冲溶液 (PBS, p H=7.4) , 20L 50 mg/m L 的探针储备液 (Cd Te/Cd SSi O 2BPEI-CQDs) , 10L 样品溶液于比色池中混匀。反应 2 min 后
13、, 在荧光仪上测定溶液荧光光谱, 根据工作曲线确定 Cu () 的含量。1.7 样品处理取健康女志愿者尿液 1.0 m L, 加入 0.1 m L 浓 HNO3酸化, 12 000 r/min 离心10 min, 取 1.0 m L 上清液用超纯水稀释至 50 m L 备用。从冰箱中取出血浆于室温下解冻, 按上述方法酸化、去蛋白后稀释至一定体积备用。2 结果与讨论2.1 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 荧光探针的表征图 2A 为 Cd Te/Cd SSi O2的透射电镜 (TEM) 图, 结果表明大量的 Cd Te/Cd S QDs 被成功包覆在 Si O2微球内。图 2B
14、为 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 的 TEM图。图 3A 为该荧光探针的 X-射线光电子能谱 (XPS) 图, 图 3B、3C、3D 分别为 C 1s、N 1s、O 1s 的高分辨谱, 表明该 CQDs 被成功修饰在 Si O2层表面。在 365 nm 光激发下, Cd Te/Cd S QDs 的荧光发射光谱波长位于 656 nm, 包覆一层 Si O2后其发射光谱发生蓝移21, 在 653 nm 处发射很强的荧光。利用 Si O2微球表面的-OH 与 BPEI-CQDs 表面-NH 2的静电作用, 在异腈酸酯存在下发生脱水作用, 成功制备了 Cd Te/Cd SSi O2
15、BPEI-CQDs 双发射荧光纳米探针 (图4) 。在 365 nm 激发下, 该探针的荧光发射光谱分别位于 450 nm、650 nm, 表明 BPEI-CQDs 被成功修饰到 Si O2层上。图 5a 为 BPEI-CQDs 的红外 (IR) 光谱图, 3 440 和 1 585 cm 处的 N-H 键的伸缩振动峰, 1 122 cm 处的 C-N 键的伸缩振动峰为聚乙烯亚胺的特征吸收峰。1 700 cm 处尖锐的吸收峰对应于酰胺键 (-CONH-) 的吸收峰。图 5b 为 Cd Te/Cd SSi O2的 IR 光谱图, 3 425 cm 处的峰对应于-OH 的伸缩振动峰。图 5c 为
16、Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 的 IR 光谱图, 1 700 cm 处的较弱的尖锐吸收峰对应于酰胺键的吸收峰, 1 585 cm 处的N-H 键的伸缩振动峰表明 BPEI-CQDs 被成功修饰到 Si O2微球层上。图 2 Cd Te/Cd SSi O2 (A) 和 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs (B) 的透射电镜 (TEM) 图 Fig.2 TEM image of Cd Te/Cd SSi O2 (A) and Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs (B) 下载原图图 3 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 的 X-射线光电
17、子能谱 (XPS) (A) 图和 C 1s (B) 、N 1s (C) 和 O 1s (D) 的高分辨 XPS 图 Fig.3 XPS of (A) and high resolution XPS, C 1s (B) , N 1s (C) , and O 1s (D) of the Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs, respectively 下载原图2.2 检测机理双发射荧光探针对于 Cu () 的响应如图 6 所示, 在 365 nm 单一激发波长下, 该荧光探针在 450 nm、650 nm 处的荧光发射光谱分别对应于 BPEI-CQDs 发射的蓝光, 及嵌入在 Si O
18、2球内的 Cd Te/Cd S QDs 发出的红光。随着 Cu () 的加入, Si O 2层内部 Cd Te/Cd S 红光量子点的发射光强度保持不变, 而 450 nm 处蓝光强度出现持续的猝灭, 表明该探针对于 Cu () 有较好的响应。2.3 p H 影响考察了不同 p H 时 Cu () 对该双发射荧光探针猝猝灭效率的影响 (图 7) 。结果表明, 当 p H 在 46 之间时, 荧光探针的荧光强度较强 (黑色) , 当体系p H 值过高或过低时, 荧光强度均有所降低。图 7 中灰色柱状表明, 酸性条件下 (p H3.0) Cu () 对荧光探针的荧光猝灭作用很小, 可能原因为酸性条
19、件下探针表面 CQDs 的-NH 2发生质子化, 无法与 Cu () 发生络合反应形成铜胺配合物。在碱性条件下 (p H7.0) 猝灭效率也较低, 可能原因为 Cu () 发生水解抑制了 Cu () 与 CQDs 表面-NH 2的络合反应。当 p H 在 47 范围内变化时, 猝灭效率较高, 且当 p H 在 57 之间变化时, 荧光探针具有较好的稳定性。综合考虑 p H 对探针稳定性、荧光猝灭效率的影响, 以及该探针用于生物样品等原因, 选择 10 mmol/L PBS (p H=7.4) 作为缓冲溶液。图 4 Cd Te/Cd S (a) 、Cd Te/Cd SSi O2 (b) 和 Cd
20、 Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs (c) 荧光发射光谱 Fig.4 Fluorescence emission spectra of Cd Te/Cd S (a) , Cd Te/Cd SSi O2 (b) and Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs (c) 图 5 BPEI-CQDs (a) 、Cd Te/Cd SSi O2 (b) 和 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs (c) 的红外 (IR) 光谱图 Fig.5 FT-IR spectra of BPEI-CQDs (a) , Cd Te/Cd S-Si O2 (b) and Cd Te/Cd S
21、Si O2BPEI-CQDs (c) 图 6 Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs 对 Cu () 的响应 Fig.6 Fluorescence emission spectra of Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs upon addition of various concentrations of Cu () 图 7 p H 对 F450/F650 的影响 Fig.7 Effect of p H on F450/F6502.4 稳定性考察在 10 mmol/L PBS (p H=7.4) 中考察了 Na Cl 浓度对 F450/F650的影响 (图 8A) 。
22、由图可知, Na Cl 浓度在 1.0101.0 mol/L 内变化时, F 450/F650保持不变。实验还考察了光照时间对 F450/F650的影响 (图 8B) , 表明在 120 min 内F450/F650没有明显降低。表明了该双发射荧光探针在苛刻条件下的高稳定性22。图 8 Na Cl 浓度 (A) 和 365 nm 光照时间 (B) 对 F450/F650 的影响 Fig.8 Effects of Na Cl concentration (A) and illumination time (B) at=365 nm on F450/F650 下载原图2.5 选择性实验在 Cu (
23、) 浓度为 60mol/L 的情况下, 考察了金属离子Hg、Cd、Mn、Fe、Ba、Al、Ca、Li、Mg、Na、K、Pb (10 倍) 对该探针检测 Cu () 的干扰 (图 9A) 。结果表明, 与未加入金属离子的 F450/F650相比, 加入其它金属离子后的 F450/F650没有发生明显的变化 (红色) 。进一步将 Cu () 加入到含有其它金属离子的探针溶液中后, F 450/F650明显降低, 表明这些共存的金属离子对该双发射荧光探针检测 Cu () 几乎没有影响 (绿色) , 进一步表明该探针对 Cu () 的高选择性。在 Cu () 浓度为 60mol/L 的情况下, 考察了
24、Trp、Glu、Ser、Ala、His、Arg、Lys、Cys、Glucose、GSH (10 倍) 对该探针检测 Cu () 的干扰。如图 9B 所示, 加入这些氨基酸后该探针的 F450/F650比值发生很小的变化 (红色) 。然而, 进一步将 Cu () 加入到含有这些氨基酸的探针溶液中, F 450/F650发生了明显降低, 表明氨基酸等物质对该双发射探针检测 Cu () 几乎没有干扰 (绿色) 。上述结果表明该体系具有很好的抗干扰能力, 能对 Cu () 进行选择性检测。图 9 金属离子 (A) 和氨基酸 (B) 对 F450/F650 的影响 Fig.9 Effects of me
25、tal ions (A) and amino acids (B) on F450/F650 下载原图2.6 方法性能在最佳条件下对该方法的性能进行了考察, 结果如图 10 所示。对 Cu () 的响应范围为 090mol/L, 当 Cu () 加入量大于 90mol/L 时, 450 nm 处的荧光强度不再发生变化 (图 10A) 。实验结果还表明, F 450/F650与 Cu () 的浓度存在良好的线性关系 (图 10B) , 线性范围为 0.4070mol/L, 其线性回归方程为:F 450/F650=2.150-0.0239c (mol/L) , R=0.994, 检测限为0.27mo
26、l/L, 低于美国环境保护局对饮用水中 Cu () 含量的要求 (1.3 ppm, 约为 20mol/L) 。随着 Cu () 加入量的增加, 450 nm、650 nm 处发射光谱强度的变化导致探针溶液在荧光灯下颜色的不断变化, 如图 10C 所示。图 1 0 Cu () 浓度对探针荧光的影响 (A) 、工作曲线 (B) 和相应的探针溶液的颜色变化 (C) Fig.10 Fluorescence responses of Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs upon addition of various concentrations of Cu () (from top to
27、 bottom, 0, 0.4, 1, 5, 10, 20, 40, 60, 70, 80, and 90mol/L) in a p H=7.4 PBS solution (A) , calibra-tion curve (B) and photographs of the color change of Cd Te/Cd SSi O2BPEI-CQDs solution (C) 下载原图2.7 样品分析为了验证该方法的可行性, 将该双发射荧光探针分别用于检测人体尿样及血浆中 Cu () 的含量, 通过加标回收的方法对该方法准确度进行了考察, 结果列于表 1 中。可以看出回收率均在 103%1
28、05%之间, 三次平行实验的相对标准偏差 (RSD) 均低于 5%。表 1 人尿液及血液中 Cu () 的测定结果 (n=3) Table 1 Determination of Cu () in urine and blood samples (n=3) 下载原表 3 结论通过将对 Cu () 有选择性识别作用的 BPEI-CQDs 与被 Si O2包裹的红光量子点 Cd Te/Cd S 相结合, 构建了一种新型双发射比率荧光探针。该探针在单一光源照射下可以发射出两种不同的荧光。基于 Cu () 与探针表面的 BPEI-CQDs的相互作用导致其荧光猝灭的现象, 可以选择性的测定 Cu () 。
29、该双发射荧光探针已被成功用于人体尿液及血浆中 Cu () 的测定。参考文献1Barnham K J, Masters C L, Bush A I.Nat Rev Drug Discov, 2004, 3 (3) :205. 2Zietz B P, Dassel de Vergara J, Dunkelberg H.Environmental Research, 2003, 92 (2) :129. 3YAO Z, YANG Y, CHEN X, et al.Analytical Chemistry, 2013, 85 (12) :5650. 4YAO J, ZHANG K, ZHU H, et
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