1、肿瘤学专业毕业论文 精品论文 抗人 VEGF 及 OPN 双特异性抗体的制备及生物学活性研究关键词：血管生成 双特异性 肿瘤治疗 基因工程抗体 血管内皮生长因子 骨桥蛋白摘要：血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF 能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续
2、生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF 在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断 VEGF 被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含 314 个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且
3、OPN 受体和血管重建关系密切，整合素 v3 和 OPN 的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama 等证实，OPN 在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制 OPN 的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF 和 OPN 在血管生成的机制中有很大关联VEGF 可诱导内皮细胞编码 v3 的 mRNA 增加，使新生血管表面有 v3 高水平表达而 VEGF 同样也可以诱导编码 OPN 的mRNA 增加，而 OPN 是 v3 的配体，二者相互作用可促进内皮细胞迁移VEGF 可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白
4、分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进 OPN 的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的 OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN 还能激活 Brk/NF-nB/ATF-4 信号转导途径来诱导 VEGF 的表达，并促进 VEGF 诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断 OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调 VEGF 的表达，进而阻止VEGF 介导的肿瘤新生血管的形成。 由上可知，如果能同时阻断 VEGF 和OPN，不但可
5、以抑制 VEGF 的促血管生成的功能和 OPN 的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性 VEGF 的表达，进而可进一步抑制 VEGF 的促血管生成作用，并减少其介导的 OPN 的酶切，从而抑制 OPN 的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断 VEGF 或 OPN 有更好的抑制肿瘤生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。 Genentech 公司的抗癌新药 Avastin(抗 VEGF 人源化抗体)已于 2004 年 2 月获得美国 FDA 批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。我们前期的研究得到一个特异性抗 OPN 的人源化抗
6、体 hu1A12，该人源化抗体，可特异性阻断OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将 Avastin 和 hu1A12 联合应用，可同时阻断 VEGF 和 OPN，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。 采用基因工程技术构建的双特性抗体可以同时阻断两个靶点。在本研究中，我们设计了一种新型的可同时阻断 VEGF 和 OPN 的双可变区的人源化抗体 DVD(dual-variable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳动
7、物细胞表达系统中获得了高效表达。我们构建的该人源化 DVD-Ig AVOPN 来源于两个特异的人源化抗体，即抗 VEGF 的人源化单克隆抗体 Avastin 和抗 OPN 的人源化单抗 hu1A12。将 Avastin 的重链可变区通过 ASTKGP 构成的 linker 与 hu1A12的重链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的重链可变区，然后与抗体的Fc 段连接，构建出 AVOPN 的重链基因；将 Avastin 的轻链可变区通过 TVAAP 构成的 linker 与 hu1A12 的轻链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的轻链可变区，然后用 overlap 的
8、方法连接上 CK，构建出 AVOPN 的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体 pcDNA3.1(+)，共转染 CHO 细胞，westernblot 检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以 rProteinA 凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE 检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达 90。ELISA 结合实验表明该 DVD-Ig 可同时结合 VEGF 和 OPN，且与 VEGF 的亲合力和 Avstin 相似，与 OPN 的亲合力和 hu1A12相似，说明该 DVD-Ig 结构既可有原来两种抗体的特异性，又保留了母源抗体的亲合力。 用人脐静脉内
9、皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测该 DVD-IgAVOPN对 VEGF 和 OPN 的阻断作用。实验结果表明 AVOPN 可有效地抑制 VEGF 和 OPN 介导的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复，与 Avastin 和 hu1A12 联合使用达到近似效果。右胁侧接种 LM3 肿瘤细胞的裸鼠用 DVD-Ig AVOPN 进行治疗，实验结果表明 DVD-IgAVOPN 具有比 Avastin 和 hu1A12 单独使用有更好的抑制血管生成作用，可显著抑制肿瘤的生成和转移，与两倍剂量的 Avastin 和 hu1A12 联合使用效果相当。 综上所述，我们构建了一个四价双特性 DVD-Ig，既保留了A
10、vastin 和 hu1A12 的亲合力，能同时阻断 VEGF 和 OPN，有效抑制血管的生成，减少肿瘤的血液供应，抑制肿瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用，可能发展成为一个新型高效的抗肿瘤治疗性抗体。正文内容血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF 能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增
11、殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF 在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断 VEGF 被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含 314 个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨架重构、
12、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且 OPN 受体和血管重建关系密切，整合素 v3 和 OPN 的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama 等证实，OPN 在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制 OPN 的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF 和 OPN 在血管生成的机制中有很大关联VEGF 可诱导内皮细胞编码 v3 的 mRNA 增加，使新生血管表面有 v3 高水平表达而 VEGF 同样也可以诱导编码 OPN 的mRNA 增加，而 OPN 是 v3 的配体，二者相互作用可促进内皮细胞迁移VEGF 可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子
13、在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进 OPN 的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的 OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN 还能激活 Brk/NF-nB/ATF-4 信号转导途径来诱导 VEGF 的表达，并促进 VEGF 诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断 OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调 VEGF 的表达，进而阻止VEGF 介导的肿瘤新生血管的形成。 由上可知，如果能
14、同时阻断 VEGF 和OPN，不但可以抑制 VEGF 的促血管生成的功能和 OPN 的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性 VEGF 的表达，进而可进一步抑制 VEGF 的促血管生成作用，并减少其介导的 OPN 的酶切，从而抑制 OPN 的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断 VEGF 或 OPN 有更好的抑制肿瘤生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。 Genentech 公司的抗癌新药 Avastin(抗 VEGF 人源化抗体)已于 2004 年 2 月获得美国 FDA 批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。我们前期的研究
15、得到一个特异性抗 OPN 的人源化抗体 hu1A12，该人源化抗体，可特异性阻断OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将 Avastin 和 hu1A12 联合应用，可同时阻断 VEGF 和 OPN，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。 采用基因工程技术构建的双特性抗体可以同时阻断两个靶点。在本研究中，我们设计了一种新型的可同时阻断 VEGF 和 OPN 的双可变区的人源化抗体 DVD(dual-variable-dom
16、ain)-IgAVOPN，并在哺乳动物细胞表达系统中获得了高效表达。我们构建的该人源化 DVD-Ig AVOPN 来源于两个特异的人源化抗体，即抗 VEGF 的人源化单克隆抗体 Avastin 和抗 OPN 的人源化单抗 hu1A12。将 Avastin 的重链可变区通过 ASTKGP 构成的 linker 与 hu1A12的重链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的重链可变区，然后与抗体的Fc 段连接，构建出 AVOPN 的重链基因；将 Avastin 的轻链可变区通过 TVAAP 构成的 linker 与 hu1A12 的轻链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的轻
17、链可变区，然后用 overlap 的方法连接上 CK，构建出 AVOPN 的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体 pcDNA3.1(+)，共转染 CHO 细胞，westernblot 检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以 rProteinA 凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE 检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达 90。ELISA 结合实验表明该 DVD-Ig 可同时结合 VEGF 和 OPN，且与 VEGF 的亲合力和 Avstin 相似，与 OPN 的亲合力和 hu1A12相似，说明该 DVD-Ig 结构既可有原来两种抗体的特异性，又保
18、留了母源抗体的亲合力。 用人脐静脉内皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测该 DVD-IgAVOPN对 VEGF 和 OPN 的阻断作用。实验结果表明 AVOPN 可有效地抑制 VEGF 和 OPN 介导的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复，与 Avastin 和 hu1A12 联合使用达到近似效果。右胁侧接种 LM3 肿瘤细胞的裸鼠用 DVD-Ig AVOPN 进行治疗，实验结果表明 DVD-IgAVOPN 具有比 Avastin 和 hu1A12 单独使用有更好的抑制血管生成作用，可显著抑制肿瘤的生成和转移，与两倍剂量的 Avastin 和 hu1A12 联合使用效果相当。 综上所述，我们构建了一个
19、四价双特性 DVD-Ig，既保留了Avastin 和 hu1A12 的亲合力，能同时阻断 VEGF 和 OPN，有效抑制血管的生成，减少肿瘤的血液供应，抑制肿瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用，可能发展成为一个新型高效的抗肿瘤治疗性抗体。血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF 能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径
20、发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF 在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断 VEGF 被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含 314 个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切
21、位点，参与调节细胞骨架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且 OPN 受体和血管重建关系密切，整合素 v3 和 OPN 的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama 等证实，OPN 在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制 OPN 的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF 和 OPN 在血管生成的机制中有很大关联VEGF 可诱导内皮细胞编码 v3 的 mRNA 增加，使新生血管表面有v3 高水平表达而 VEGF 同样也可以诱导编码 OPN 的 mRNA 增加，而 OPN 是v3 的配体，二者相互作用可促进内皮细胞迁移VEGF 可以迅速增加微血管
22、的通透性，导致包括凝血因子在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进 OPN 的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN 还能激活 Brk/NF-nB/ATF-4 信号转导途径来诱导 VEGF 的表达，并促进 VEGF 诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断 OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调 VEGF 的表达，进而阻止 VEGF 介导的肿瘤新生血管
23、的形成。由上可知，如果能同时阻断 VEGF 和 OPN，不但可以抑制 VEGF 的促血管生成的功能和 OPN 的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性 VEGF 的表达，进而可进一步抑制 VEGF 的促血管生成作用，并减少其介导的 OPN 的酶切，从而抑制 OPN的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断 VEGF 或 OPN 有更好的抑制肿瘤生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。 Genentech公司的抗癌新药 Avastin(抗 VEGF 人源化抗体)已于 2004 年 2 月获得美国 FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的
24、治疗。我们前期的研究得到一个特异性抗 OPN 的人源化抗体hu1A12，该人源化抗体，可特异性阻断 OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将 Avastin 和 hu1A12 联合应用，可同时阻断 VEGF 和 OPN，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。 采用基因工程技术构建的双特性抗体可以同时阻断两个靶点。在本研究中，我们设计了一种新型的可同时阻断 VEGF 和 OPN 的双可变区的人源化抗体 DVD(dual-va
25、riable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳动物细胞表达系统中获得了高效表达。我们构建的该人源化 DVD-Ig AVOPN 来源于两个特异的人源化抗体，即抗 VEGF的人源化单克隆抗体 Avastin 和抗 OPN 的人源化单抗 hu1A12。将 Avastin 的重链可变区通过 ASTKGP 构成的 linker 与 hu1A12 的重链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的重链可变区，然后与抗体的 Fc 段连接，构建出 AVOPN 的重链基因；将 Avastin 的轻链可变区通过 TVAAP 构成的 linker 与 hu1A12 的轻链可变区的 N 末端串联在一起构
26、成了 AVOPN 的轻链可变区，然后用 overlap 的方法连接上 CK，构建出 AVOPN 的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体 pcDNA3.1(+)，共转染 CHO 细胞，westernblot 检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以 rProteinA 凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE 检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达90。ELISA 结合实验表明该 DVD-Ig 可同时结合 VEGF 和 OPN，且与 VEGF 的亲合力和 Avstin 相似，与 OPN 的亲合力和 hu1A12 相似，说明该 DVD-Ig 结构既可有原来
27、两种抗体的特异性，又保留了母源抗体的亲合力。 用人脐静脉内皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测该 DVD-IgAVOPN 对 VEGF 和 OPN 的阻断作用。实验结果表明 AVOPN 可有效地抑制 VEGF 和 OPN 介导的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复，与 Avastin 和 hu1A12 联合使用达到近似效果。右胁侧接种 LM3 肿瘤细胞的裸鼠用 DVD-Ig AVOPN 进行治疗，实验结果表明 DVD-IgAVOPN 具有比Avastin 和 hu1A12 单独使用有更好的抑制血管生成作用，可显著抑制肿瘤的生成和转移，与两倍剂量的 Avastin 和 hu1A12 联合使用效果相当。 综
28、上所述，我们构建了一个四价双特性 DVD-Ig，既保留了 Avastin 和 hu1A12 的亲合力，能同时阻断 VEGF 和 OPN，有效抑制血管的生成，减少肿瘤的血液供应，抑制肿瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用，可能发展成为一个新型高效的抗肿瘤治疗性抗体。血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF 能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激
29、活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF 在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断 VEGF 被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含 314 个氨基酸残基的磷酸化糖
30、蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且 OPN 受体和血管重建关系密切，整合素 v3 和 OPN 的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama 等证实，OPN 在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制 OPN 的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF 和 OPN 在血管生成的机制中有很大关联VEGF 可诱导内皮细胞编码 v3 的 mRNA 增加，使新生血管表面有v3 高水平表达而 VEGF 同样也可以诱导编码 OPN 的 mRNA 增加，而 OPN 是v3 的配体，二者相互作用可促进内皮细胞迁移VE
31、GF 可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进 OPN 的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN 还能激活 Brk/NF-nB/ATF-4 信号转导途径来诱导 VEGF 的表达，并促进 VEGF 诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断 OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调 VEGF 的表达，进而阻止 VE
32、GF 介导的肿瘤新生血管的形成。由上可知，如果能同时阻断 VEGF 和 OPN，不但可以抑制 VEGF 的促血管生成的功能和 OPN 的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性 VEGF 的表达，进而可进一步抑制 VEGF 的促血管生成作用，并减少其介导的 OPN 的酶切，从而抑制 OPN的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断 VEGF 或 OPN 有更好的抑制肿瘤生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。 Genentech公司的抗癌新药 Avastin(抗 VEGF 人源化抗体)已于 2004 年 2 月获得美国 FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，
33、包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。我们前期的研究得到一个特异性抗 OPN 的人源化抗体hu1A12，该人源化抗体，可特异性阻断 OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将 Avastin 和 hu1A12 联合应用，可同时阻断 VEGF 和 OPN，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。 采用基因工程技术构建的双特性抗体可以同时阻断两个靶点。在本研究中，我们设计了一种新型的可同时阻断 VEGF 和 OPN 的双可变区的人源化抗体
34、 DVD(dual-variable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳动物细胞表达系统中获得了高效表达。我们构建的该人源化 DVD-Ig AVOPN 来源于两个特异的人源化抗体，即抗 VEGF的人源化单克隆抗体 Avastin 和抗 OPN 的人源化单抗 hu1A12。将 Avastin 的重链可变区通过 ASTKGP 构成的 linker 与 hu1A12 的重链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的重链可变区，然后与抗体的 Fc 段连接，构建出 AVOPN 的重链基因；将 Avastin 的轻链可变区通过 TVAAP 构成的 linker 与 hu1A12 的轻链可变区
35、的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的轻链可变区，然后用 overlap 的方法连接上 CK，构建出 AVOPN 的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体 pcDNA3.1(+)，共转染 CHO 细胞，westernblot 检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以 rProteinA 凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE 检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达90。ELISA 结合实验表明该 DVD-Ig 可同时结合 VEGF 和 OPN，且与 VEGF 的亲合力和 Avstin 相似，与 OPN 的亲合力和 hu1A12 相似，说明该 DV
36、D-Ig 结构既可有原来两种抗体的特异性，又保留了母源抗体的亲合力。 用人脐静脉内皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测该 DVD-IgAVOPN 对 VEGF 和 OPN 的阻断作用。实验结果表明 AVOPN 可有效地抑制 VEGF 和 OPN 介导的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复，与 Avastin 和 hu1A12 联合使用达到近似效果。右胁侧接种 LM3 肿瘤细胞的裸鼠用 DVD-Ig AVOPN 进行治疗，实验结果表明 DVD-IgAVOPN 具有比Avastin 和 hu1A12 单独使用有更好的抑制血管生成作用，可显著抑制肿瘤的生成和转移，与两倍剂量的 Avastin 和 hu1A12
37、 联合使用效果相当。 综上所述，我们构建了一个四价双特性 DVD-Ig，既保留了 Avastin 和 hu1A12 的亲合力，能同时阻断 VEGF 和 OPN，有效抑制血管的生成，减少肿瘤的血液供应，抑制肿瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用，可能发展成为一个新型高效的抗肿瘤治疗性抗体。血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF 能与细胞表面的血管内皮
38、生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF 在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断 VEGF 被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人骨桥蛋白是一种含 314
39、 个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且 OPN 受体和血管重建关系密切，整合素 v3 和 OPN 的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama 等证实，OPN 在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制 OPN 的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF 和 OPN 在血管生成的机制中有很大关联VEGF 可诱导内皮细胞编码 v3 的 mRNA 增加，使新生血管表面有v3 高水平表达而 VEGF 同样也可以诱导编码 OPN 的 mRNA 增加，而 OPN 是v3 的配体，二者相互作
40、用可促进内皮细胞迁移VEGF 可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进 OPN 的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN 还能激活 Brk/NF-nB/ATF-4 信号转导途径来诱导 VEGF 的表达，并促进 VEGF 诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断 OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调 VEGF
41、 的表达，进而阻止 VEGF 介导的肿瘤新生血管的形成。由上可知，如果能同时阻断 VEGF 和 OPN，不但可以抑制 VEGF 的促血管生成的功能和 OPN 的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性 VEGF 的表达，进而可进一步抑制 VEGF 的促血管生成作用，并减少其介导的 OPN 的酶切，从而抑制 OPN的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断 VEGF 或 OPN 有更好的抑制肿瘤生长转移的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。 Genentech公司的抗癌新药 Avastin(抗 VEGF 人源化抗体)已于 2004 年 2 月获得美国 FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠
42、癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。我们前期的研究得到一个特异性抗 OPN 的人源化抗体hu1A12，该人源化抗体，可特异性阻断 OPN，在体内外有明显的抗肿瘤活性。若将 Avastin 和 hu1A12 联合应用，可同时阻断 VEGF 和 OPN，进一步提高抗肿瘤治疗效果。但是，单抗联合应用具有很多限制。首先，临床上同时应用两种抗体的的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。 采用基因工程技术构建的双特性抗体可以同时阻断两个靶点。在本研究中，我们设计了一种新型的可同时阻断 VEGF 和 OPN
43、 的双可变区的人源化抗体 DVD(dual-variable-domain)-IgAVOPN，并在哺乳动物细胞表达系统中获得了高效表达。我们构建的该人源化 DVD-Ig AVOPN 来源于两个特异的人源化抗体，即抗 VEGF的人源化单克隆抗体 Avastin 和抗 OPN 的人源化单抗 hu1A12。将 Avastin 的重链可变区通过 ASTKGP 构成的 linker 与 hu1A12 的重链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的重链可变区，然后与抗体的 Fc 段连接，构建出 AVOPN 的重链基因；将 Avastin 的轻链可变区通过 TVAAP 构成的 linker 与 h
44、u1A12 的轻链可变区的 N 末端串联在一起构成了 AVOPN 的轻链可变区，然后用 overlap 的方法连接上 CK，构建出 AVOPN 的轻链基因。将上述轻重链基因分别装入真核表达载体 pcDNA3.1(+)，共转染 CHO 细胞，westernblot 检测正确表达后，挑选出稳定高表达的克隆大量扩增表达，收集培养上清以 rProteinA 凝胶层析柱纯化，SDS-PAGE 检测蛋白，鉴定了蛋白分子量与理论分子量相符，纯度可达90。ELISA 结合实验表明该 DVD-Ig 可同时结合 VEGF 和 OPN，且与 VEGF 的亲合力和 Avstin 相似，与 OPN 的亲合力和 hu1A
45、12 相似，说明该 DVD-Ig 结构既可有原来两种抗体的特异性，又保留了母源抗体的亲合力。 用人脐静脉内皮细胞增殖试验、划痕修复试验检测该 DVD-IgAVOPN 对 VEGF 和 OPN 的阻断作用。实验结果表明 AVOPN 可有效地抑制 VEGF 和 OPN 介导的人脐静脉内皮细胞增殖及划痕修复，与 Avastin 和 hu1A12 联合使用达到近似效果。右胁侧接种 LM3 肿瘤细胞的裸鼠用 DVD-Ig AVOPN 进行治疗，实验结果表明 DVD-IgAVOPN 具有比Avastin 和 hu1A12 单独使用有更好的抑制血管生成作用，可显著抑制肿瘤的生成和转移，与两倍剂量的 Avas
46、tin 和 hu1A12 联合使用效果相当。 综上所述，我们构建了一个四价双特性 DVD-Ig，既保留了 Avastin 和 hu1A12 的亲合力，能同时阻断 VEGF 和 OPN，有效抑制血管的生成，减少肿瘤的血液供应，抑制肿瘤的生长，显示出良好的体内抗肿瘤作用，可能发展成为一个新型高效的抗肿瘤治疗性抗体。血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，使肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF
47、 能与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内、皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。大量结果证明，VEGF 在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断 VEGF 被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。 肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。有研究发现，在肝癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌等多种癌组织中均可发现骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)表达增加。进一步研究发现，人
48、骨桥蛋白是一种含 314 个氨基酸残基的磷酸化糖蛋白，含有凝血酶的的酶切位点，参与调节细胞骨架重构、细胞凋亡、细胞增殖和迁移等过程，且 OPN 受体和血管重建关系密切，整合素 v3 和 OPN 的共同表达可以刺激内皮细胞迁移。Hirama 等证实，OPN 在肿瘤生长过程中新生血管形成的机制起到了重要的作用。因此，抑制 OPN 的活性可阻断肿瘤血管生成，抑制肿瘤的生长。 大量研究表明，VEGF 和 OPN 在血管生成的机制中有很大关联VEGF 可诱导内皮细胞编码 v3 的 mRNA 增加，使新生血管表面有v3 高水平表达而 VEGF 同样也可以诱导编码 OPN 的 mRNA 增加，而 OPN 是
49、v3 的配体，二者相互作用可促进内皮细胞迁移VEGF 可以迅速增加微血管的通透性，导致包括凝血因子在内的血浆蛋白浓度增高，上调一些蛋白分子的表达，如生长因子，粘附分子，蛋白酶，蛋白酶受体，易于激活外源性凝血途径，产生凝血酶，促进 OPN 的酶切。体外实验结果证实，经凝血酶酶切的OPN，其粘附力比未经酶切者强，能大大提高内皮细胞的迁移速度，促进微血管的生成。此外，OPN 还能激活 Brk/NF-nB/ATF-4 信号转导途径来诱导 VEGF 的表达，并促进 VEGF 诱导内皮细胞增生的作用，进而促进新生血管形成，加快肿瘤细胞的生长及转移。所以，如果能阻断 OPN，不但可以抑制其促肿瘤血管生成的作用，还可以下调 VEGF 的表达，进而阻止 VEGF 介导的肿瘤新生血管的形成。由上可知，如果能同时阻断 VEGF 和 OPN，不但可以抑制 VEGF 的促血管生成的功能和 OPN 的促进肿瘤转移的功能，还将降低内源性 VEGF 的表达，进而可进一步抑制 VEGF 的促血管生成作用，并减少其介导的 OPN 的酶切，从而抑制 OPN的促进血管生成和肿瘤转移的功能，故可能会比单独阻断 V
