1、心血管内科专业优秀论文 血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义及siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响关键词：TLR4 脂多糖 血管平滑肌细胞 MMP-2 MMP-9 蛋白表达 siRNA摘要：第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究血管平滑肌细胞TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h 和 48h。应用琼脂糖电泳鉴定 PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用
2、条件下 TLR4 mRNA表达进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达； TLR4 mRNA 在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉
3、平滑肌细胞表达 TLR4；LPS 调节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4的表达发生时间和剂量依赖性变化。 第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化。明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞
4、核因子-B(NF-B)的结合活性。抗受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果： 1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LPS 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3LPS通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LPS对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4LPS 能够通过其受体 TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。
5、5受体 TLR4依赖 NF-B 激活途径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9 mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR
6、4 mRNA表达进行定量分析。Western blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果： 1转染的 siRNA序列本身不会对细胞生存率产生影响，同时也说明 siRNA序列本身是安全的。 23 个不同序列 siRNA
7、对血管平滑肌细胞 TLR4 mRNA表达的抑制效率不同，以 TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3转染 TLR4基因siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9 mRNA表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9mRNA表达都没有影响。 4转染TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9蛋白表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9蛋白表达都没有影响。 5转染 TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9酶活性的上调作用，而对MMP-2酶活性没有影响。
8、单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9酶活性都没有影响。 结论：转染的 siRNA-TLR4序列本身不会对细胞生存率产生影响。转染TLR4基因 siRNA-1在抑制血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的表达的同时，明显抑制LPS对 MMP-9 mRNA，蛋白表达和酶活性的上调作用，而对 MMP-2没有影响。正文内容第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究血管平滑肌细胞TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs
9、0h，2h，4h，6h，12h，24h 和 48h。应用琼脂糖电泳鉴定 PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用条件下 TLR4 mRNA表达进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达； TLR4 mRNA 在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR
10、4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉平滑肌细胞表达 TLR4；LPS 调节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4的表达发生时间和剂量依赖性变化。 第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot法测定 10ng/ml L
11、PS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化。明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞核因子-B(NF-B)的结合活性。抗受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果： 1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LPS 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3LPS通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LP
12、S对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4LPS 能够通过其受体 TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。 5受体 TLR4依赖 NF-B 激活途径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9 mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39
13、;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR4 mRNA表达进行定量分析。Western blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果：
14、1转染的 siRNA序列本身不会对细胞生存率产生影响，同时也说明 siRNA序列本身是安全的。 23 个不同序列 siRNA对血管平滑肌细胞 TLR4 mRNA表达的抑制效率不同，以 TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3转染 TLR4基因siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9 mRNA表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9mRNA表达都没有影响。 4转染TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9蛋白表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9蛋白表达都没
15、有影响。 5转染 TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9酶活性的上调作用，而对MMP-2酶活性没有影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9酶活性都没有影响。 结论：转染的 siRNA-TLR4序列本身不会对细胞生存率产生影响。转染TLR4基因 siRNA-1在抑制血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的表达的同时，明显抑制LPS对 MMP-9 mRNA，蛋白表达和酶活性的上调作用，而对 MMP-2没有影响。第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HAS
16、MCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h 和 48h。应用琼脂糖电泳鉴定PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用条件下 TLR4 mRNA表达进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；
17、 TLR4 mRNA在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉平滑肌细胞表达TLR4；LPS 调节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4 的表达发生时间和剂量依赖性变化。 第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖
18、电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot 法测定10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化。明胶酶谱法测定MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞核因子-B(NF-B)的结合活性。抗受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果： 1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LPS 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3L
19、PS 通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LPS对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4LPS 能够通过其受体TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。 5受体 TLR4依赖 NF-B激活途径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B 途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9 mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影
20、响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR4 mRNA表达进行定量分析。Western blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/m
21、l LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果： 1转染的 siRNA序列本身不会对细胞生存率产生影响，同时也说明 siRNA序列本身是安全的。 23 个不同序列 siRNA对血管平滑肌细胞 TLR4 mRNA表达的抑制效率不同，以 TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3转染 TLR4基因siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9 mRNA表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9mRNA表达都没有影响。 4转染TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9蛋白
22、表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9蛋白表达都没有影响。 5转染 TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9酶活性的上调作用，而对MMP-2酶活性没有影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9酶活性都没有影响。 结论：转染的 siRNA-TLR4序列本身不会对细胞生存率产生影响。转染TLR4基因 siRNA-1在抑制血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的表达的同时，明显抑制LPS对 MMP-9 mRNA，蛋白表达和酶活性的上调作用，而对 MMP-2没有影响。第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究
23、血管平滑肌细胞 TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h 和 48h。应用琼脂糖电泳鉴定PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用条件下 TLR4 mRNA表达进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结
24、果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达； TLR4 mRNA在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉平滑肌细胞表达TLR4；LPS 调节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4 的表达发生时间和剂量依赖性变化。 第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动
25、脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot 法测定10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化。明胶酶谱法测定MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞核因子-B(NF-B)的结合活性。抗受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果： 1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LP
26、S 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3LPS 通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LPS对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4LPS 能够通过其受体TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。 5受体 TLR4依赖 NF-B激活途径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B 途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9 mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分
27、： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR4 mRNA表达进行定量分析。Western blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂
28、糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果： 1转染的 siRNA序列本身不会对细胞生存率产生影响，同时也说明 siRNA序列本身是安全的。 23 个不同序列 siRNA对血管平滑肌细胞 TLR4 mRNA表达的抑制效率不同，以 TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3转染 TLR4基因siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9 mRNA表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-
29、2和 MMP-9mRNA表达都没有影响。 4转染TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9蛋白表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9蛋白表达都没有影响。 5转染 TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9酶活性的上调作用，而对MMP-2酶活性没有影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9酶活性都没有影响。 结论：转染的 siRNA-TLR4序列本身不会对细胞生存率产生影响。转染TLR4基因 siRNA-1在抑制血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的表达的同时，明显抑制LPS对 MMP-9 mRN
30、A，蛋白表达和酶活性的上调作用，而对 MMP-2没有影响。第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h 和 48h。应用琼脂糖电泳鉴定PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用条件下 TLR4 mRNA表达进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同
31、作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达； TLR4 mRNA在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉平滑肌细胞表达TLR4；LPS 调节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4 的表达发生时间和剂量依赖性变化。
32、第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot 法测定10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化。明胶酶谱法测定MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞核因子-B(NF-B)的结合活性。抗受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果：
33、1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LPS 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3LPS 通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LPS对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4LPS 能够通过其受体TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。 5受体 TLR4依赖 NF-B激活途径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B 途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9
34、mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR4 mRNA表达进行定量分析。Western blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;T
35、Mgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果： 1转染的 siRNA序列本身不会对细胞生存率产生影响，同时也说明 siRNA序列本身是安全的。 23 个不同序列 siRNA对血管平滑肌细胞 TLR4 mRNA表达的抑制效率不同，以 TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3转染 TLR4基因siRNA-1明显抑制 L
36、PS对 MMP-9 mRNA表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9mRNA表达都没有影响。 4转染TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9蛋白表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9蛋白表达都没有影响。 5转染 TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9酶活性的上调作用，而对MMP-2酶活性没有影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9酶活性都没有影响。 结论：转染的 siRNA-TLR4序列本身不会对细胞生存率产生影响。转染T
37、LR4基因 siRNA-1在抑制血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的表达的同时，明显抑制LPS对 MMP-9 mRNA，蛋白表达和酶活性的上调作用，而对 MMP-2没有影响。第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h 和 48h。应用琼脂糖电泳鉴定PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用条件下 TLR4 mRNA表达
38、进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达； TLR4 mRNA在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉平滑肌细胞表达TLR4；LPS 调
39、节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4 的表达发生时间和剂量依赖性变化。 第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot 法测定10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化。明胶酶谱法测定MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞核因子-B(NF-B)的结合活性。抗
40、受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果： 1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LPS 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3LPS 通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LPS对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4LPS 能够通过其受体TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。 5受体 TLR4依赖 NF-B激活途
41、径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B 途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9 mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR4 mRNA表达进行定量分析。Wes
42、tern blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果： 1转染的 siRNA序列本身不会对细胞生存率产生影响，同时也说明 siRNA序列本身是安全的。 23 个不同序列 siRNA对血管平滑肌细胞 TLR4 mRNA
43、表达的抑制效率不同，以 TLR4 siRNA-1抑制效率最高。 3转染 TLR4基因siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9 mRNA表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9mRNA表达都没有影响。 4转染TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9蛋白表达的上调作用，而对 MMP-2的表达无影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-2和 MMP-9蛋白表达都没有影响。 5转染 TLR4基因 siRNA-1明显抑制 LPS对 MMP-9酶活性的上调作用，而对MMP-2酶活性没有影响。单独转染 siRNA-1对 MMP-
44、2和 MMP-9酶活性都没有影响。 结论：转染的 siRNA-TLR4序列本身不会对细胞生存率产生影响。转染TLR4基因 siRNA-1在抑制血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的表达的同时，明显抑制LPS对 MMP-9 mRNA，蛋白表达和酶活性的上调作用，而对 MMP-2没有影响。第一部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达及在脂多糖(LPS)作用下的表达变化特点。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。不同浓度 LPS作用于 HASMCs 24小时；10ng/ml LPS作用于 HASMCs 0h，2h，4h，6h，12h，24h 和
45、 48h。应用琼脂糖电泳鉴定PCR产物；实时荧光定量 PCR法对 LPS不同作用条件下 TLR4 mRNA表达进行定量分析。免疫荧光检测血管平滑肌细胞 TLR4蛋白的位置及分布；Western blot法测定 LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化；流式细胞仪进一步检测LPS不同作用条件下 TLR4蛋白表达量的变化。 结果： 1正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4 mRNA。LPS 调节 HASMCs TLR4表达； TLR4 mRNA在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 2正常情况下，人主动脉平滑肌细胞表达少量 TLR4蛋白。LPS 调节 HASMCs TLR4表达
46、；受体 TLR4蛋白在 LPS作用下发生时间和剂量依赖性变化。 结论：人动脉平滑肌细胞表达TLR4；LPS 调节 HASMCs TLR4表达，且在炎性因素作用下，HASMCs TLR4 的表达发生时间和剂量依赖性变化。 第二部分：血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义 目的：研究血管平滑肌细胞 TLR4的表达意义。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。10ng/ml LPS 作用于 HASMCs 24h。应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物。Western blot 法测定10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量
47、的变化。明胶酶谱法测定MMP-2，9 活性。EMSA 法测定动脉平滑肌细胞核因子-B(NF-B)的结合活性。抗受体 TLR4抗体抑制 LPS激活受体 TLR4。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐抑制 NF-B 的结合活性。 结果： 1LPS 通过其受体 TLR4调节 MMP-9 mRNA的表达，而对 MMP-2 mRNA表达无影响。 2LPS 上调的 MMP-9 mRNA能够翻译表达更多量的 MMP-9蛋白；而对 MMP-2蛋白的表达无影响。 3LPS 通过其受体 TLR4使血管平滑肌细胞内 MMP-9表达增加的同时，使 MMP-9酶解活性相应增加；而 LPS对 MMP-2的酶解活性也没有产生影响。 4L
48、PS 能够通过其受体TLR4影响血管平滑肌细胞内 NF-B 的结合活性。 5受体 TLR4依赖 NF-B激活途径调节 MMP-9的表达及活性。 结论：LPS 通过 TLR4-NF-B 途径调节血管平滑肌细胞 MMP-9 mRNA和蛋白表达及其活性；而激活受体 TLR4对 MNIP-2 mRNA和蛋白表达及其活性无影响。 第三部分： siRNA-TLR4 对血管平滑肌细胞功能的影响 目的：研究 siRNA-TLR4对血管平滑肌细胞功能的影响。 方法：培养人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)，传到 79 代。应用Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 siRNA-TLR4。MTT 法测定细胞生存率。实时荧光定量 PCR法对转染 siRNA后 TLR4 mRNA表达进行定量分析。Western blot 法检测转染 siRNA后 TLR4蛋白表达变化。Lipofectaminelt;#39;TMgt;2000转染 TLR4 siRNA-1后，10ng/ml LPS作用于 HASMCs 24h，应用琼脂糖电泳鉴定基质金属蛋白酶-2，9(MMPs)RT-PCR 产物；Western blot 法测定 10ng/ml LPS作用 24小时后，MMP-2，9 蛋白表达量的变化；明胶酶谱法测定 MMP-2，9 活性。 结果： 1转染的
