1、大鼠血管平滑肌细胞的培养,金洪峰,细胞培养方法,组织块培养法 消化培养法 器官培养法,将组织剪成小块后接种于培养瓶 特点：简便易行、成功率较高。,细胞培养方法,组织块培养法 消化培养法 器官培养法,结合生化和化学手段把已经剪切成较小体积的组织进行进一步分离，制成细胞悬液。主要有： 胰蛋白酶法 胶原酶法 EDTA 法,细胞培养方法,组织块培养法 消化培养法 器官培养法,从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。,体外培养细胞的分型,贴附型: 细胞贴附在支持物上生长悬浮型：不贴附于支持物，呈悬浮生长,细胞培养实验室 培养用品 细胞培养
2、液、培养基,准备,“无菌”,细胞培养实验室,无菌操作区（无菌操作室、 超净台） 孵育区 制备区 储藏区 清洗和消毒灭菌区,培养试剂的配制,Hanks液 (单位g) CaCl2 0.14 KCl 0.4 KH2PO4 0.06 MgSO4.7H2O 0.10 NaCl 8.0 NaHCO3 0.35 Na2HPO4.12H2O 0.12 D-glucose 1.0 Phenol red 0.01,将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中，其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟，4冰箱保存。,D-Hanks液 （单位：
3、g） KCl 0.40 KH2PO4 0.06 NaCl 8.0 NaHCO3 0.35 Na2HPO4.12H2O 0.08 Phenol red 0.02,将以上成分溶于900mL ddH2O中，充分混匀，加ddH2O至1000 mL。高压蒸气消毒10分钟，4冰箱保存。,青霉素、链霉素液配制 青霉素80万U加Hanks液至80 mL，终浓度1万u/ mL 链霉素100万U（相当于1g）加Hanks液至100 mL，终浓度10mg/mL 分装后至-20冰箱保存。,DMEM培养液 900 mL ddH2O于1000 mL容器中，将DMEM粉1包倒入容器中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗
4、，也倒入容器，磁力搅拌溶解。 加NaHCO3 调PH至7.2 加青、链霉素至终浓度100u/mL 和100ug/mL 0.22umX50滤膜过滤（负压泵抽吸），4冰箱保存。,小牛、胎牛血清灭活 55水浴箱30分钟，置4冰箱保存 灭活前放于-20冰箱保存待用 临用前加入DMEM液中,平滑肌细胞原代培养方法,动物：大鼠150180g，23只,操作步骤,大鼠颈椎脱臼致死 固定,消毒胸腹部 大组织镊、组织剪切开胸腹部皮肤 另一组织镊、组织剪切开胸腹部，并切除部分胸壁以利暴露 眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hanks液的细胞培养皿中，转入无菌室。或先用生理盐水漂洗，再放Hanks液中，转入无菌
5、室,眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层。 放入另一盛有Hanks液的细胞培养皿中，剪去血管外的小分支,放入含20%胎牛血清的DMEM中，眼科直剪剪开血管腔，以眼科弯镊轻轻擦拭内膜层，以去除内皮细胞 放入另一含20%胎牛血清的DMEM中，用眼科弯剪剪碎血管组织至1mm,用吸管把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为0.5cm,盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注入适量培养液，于37C孵箱内放置45小时，使得组织块干涸，并与瓶底贴附 将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置35天，切勿移动。待有细胞从组织块周围游离出后换液,平滑肌细胞传代,传代时间：大部分组
6、织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相接触时就可以传代,传代步骤： 倒掉培养瓶中的培养液 用D-Hanks液洗两遍 加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞消化情况，可见到细胞质回缩，细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞脱离消化液,注意：初次传代对胰酶敏感，加入消化液30s，即消化充分，以后2分钟左右,细胞消化完成后，用吸管反复抽吸打散细胞 中止消化：加入DMEM培养液3滴管，用吸管反复吹打瓶壁细胞 离心：1500 X5分钟 倒掉液体，加D-Hanks液洗一次，再加10mL DMEM培养液，用吸管抽吸吹打分散细胞，分装于2个培养瓶。在倒置纤微镜下可见圆形细胞。放入细胞培
7、养箱中培养,血管平滑肌细胞的冻存和复苏,冻存时间：较早期传代，以防细胞因为传代次数过多而造成细胞衰老或发生改变，以保持实验条件的一致性。 冻存方法：冻存前24小时更换培养液，冻存时要将密闭好的冻存管依次放于：4C 2小时-20C 2.5小时液氮表面 2小时浸入液氮,培养细胞的鉴定,1、形态学鉴定：用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律。并依据常规制作电镜标本进行观察电镜观察结果：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向排列，有密区，具备平滑肌细胞特征,2、免疫组织化学鉴定：特异性鼠抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色免疫组织化学鉴定结果：镜下观察到细胞爬片，可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不着色。所有细胞染色，结果均为阳性,
