1、基础兽医学专业毕业论文 精品论文 大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的克隆与表达菌株的初步筛选关键词：大肠杆菌 多重耐药 acrB marR pPICZA 载体 基因克隆 菌株筛选摘要：由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB 及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药
2、敏质控株 ATCC25922及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与 GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR 基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发
3、生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了 marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.co
4、li TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参
5、考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。正文内容由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因acrB 及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规
6、方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与 GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR 基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突
7、变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了 marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产
8、物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC外输
9、泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论
10、文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR基因未发生突变外，其余的部分碱基
11、均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接
12、、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-To
13、lC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义
14、。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR基因未发生突变外，其余的
15、部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产
16、物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrA
17、B-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有
18、重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR基因未发生突变外
19、，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶
20、切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其
21、AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药
22、机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR基因未发
23、生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双
24、酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入
25、研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研究大肠杆
26、菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的 marR
27、基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 pPICZ
28、A 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分析结果，
29、可为深入研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究对深入研
30、究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐药菌的
31、marR基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体质粒 p
32、PICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源性比较分
33、析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR 的研究
34、对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除 1 株耐
35、药菌的 marR基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及表达载体
36、质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸序列同源
37、性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因 marR
38、 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 100；除
39、1 株耐药菌的 marR基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆质粒以及
40、表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR 的核苷酸
41、序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。由于在治疗大肠杆菌病过程中的抗生素频繁、广泛及不合理应用，导致大肠杆菌多重耐药的现象日益严重，大肠杆菌对多种抗生素耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为 AcrAB-TolC 外输泵是最主要的外输系统，若使该系统失活，大肠杆菌可从多重耐药状态变为相对敏感状态。对大肠杆菌转运基因 acrB及其多重耐药操纵抑制基因
42、marR 的研究对深入研究大肠杆菌的耐药机制具有重要意义。 本论文采用常规方法提取大肠杆菌药敏质控株 ATCC25922 及 5 株动物源性不同、耐药水平不同的临床分离多重耐药大肠杆菌的 acrB、marR 基因的染色体 DNA，通过其特异性引物的设计、PCR 扩增、PCR 产物与克隆载体 pMD-18T 的连接、连接产物转化至大肠杆菌 JM109 感受态中以及对酶切及 PCR 鉴定为阳性的克隆质粒序列测定，获得了受试菌的 acrB、marR 全基因序列。测序结果表明，所测得的 3 株不同动物源性大肠杆菌的 acrB 基因的核苷酸序列与GeneBank 中发表的该基因核苷酸序列的同源性为 10
43、0；除 1 株耐药菌的 marR基因未发生突变外，其余的部分碱基均发生了突变，个别氨基酸也发生了变化。与 GeneBank 中发表的该基因序列对比分析，核苷酸序列的同源性在 97.5-98.2之间，氨基酸序列的同源性在 97.3-98.6，其中包括两处共同突变：307 位 GA，氨基酸 GlySer；409 位 TC，氨基酸 TryHis。其中鸡源高耐药株的核苷酸突变位点最多。上述耐药株的 marR 基因突变位点是否影响了marR 对 AcrAB-TolC 外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待于进一步研究。 在对 acrB、marR 基因进行克隆及同源性比较分析的基础上，通过对克隆
44、质粒以及表达载体质粒 pPICZA 的双酶切、酶切回收产物的连接、连接产物转化至 E.coli TOP10 感受态中、重组质粒 pPICZA-acrB 和pPICZA-mar 的酶切及 PCR 鉴定、表达重组质粒 pPICZA-acrB 和 pPICZA-marR 经 Sac酶线性化、线性化质粒电转化至 GS115 酵母感受态细胞中，煮-冻-煮法提取重组酵母基因组，PCR 法进行阳性基因整合酵母的筛选，1琼脂糖凝胶电泳结果显示 acrB、marR 基因已整合入 GS115 染色体上，PCR 产物的分子量分别约为 1.6Kb、1.0Kb。 本试验获得的临床分离大肠杆菌耐药基因acrB、marR
45、的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其 AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；初步筛选出 acrB、marR 基因的毕赤酵母表达菌株，将为进一步诱导其在毕赤酵母中表达、制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌?U 閩 AZ箾 FTP 鈦X 飼?狛P
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