1、外科学(神经外)专业优秀论文 ALA 光动力诊断与光动力治疗恶性脑肿瘤的疗效及机制研究关键词：胶质瘤 5 氨基乙酰丙酸 光动力诊断 光动力治疗 脑肿瘤 凋亡机制 动物模型摘要：脑肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病，神经胶质瘤又是颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤有向正常脑组织中侵润性生长的特性，尤其在脑重要功能区及附近时，无法将肿瘤完全切除，术后易复发。放疗、化疗虽可杀伤肿瘤细胞，但同时亦会损伤部分正常脑组织，并可能会出现严重的全身不良反应。近来许多学者将荧光光谱学技术用于肿瘤检测，利用自体荧光或药物荧光的检测方法，可以发现肉眼难以察觉或辨认的微小病变，从而显著提高癌前病变和微小癌的检出率。 光动力
2、诊断(Photodynamic Diagnosis，PDD)是一种通过以特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应以诊断肿瘤的方法，即输入外源性光敏剂一定时间后，这些光敏物质可以较高的浓度存留在肿瘤组织或肿瘤细胞中，从而与肿瘤周围的正常器官组织形成浓度差，这时如以特定波长的光照射肿瘤部位，就可能激发出特殊形状和强度的光谱图，或在荧光手术显微镜下显色可提示该处可能有肿瘤存在。而光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)则是利用光敏剂和激光活化进行疾病治疗的新方法，其基本原理是肿瘤组织可选择性吸收光敏剂，并在一定时间内肿瘤组织中光敏剂的含量较正常组织多出
3、数 10 倍，此时用特定波长的光源照射肿瘤部位，活化光敏剂，产生光化学反应，损伤多种细胞靶点，破坏肿瘤组织，从而达到选择性治疗肿瘤目的。 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是一种活化光敏剂。研究发现，ALA-PDD 或 ALA-PDT 相对于普通的诊断治疗方法，能明显提高脑肿瘤诊断治疗效果，但联合 ALA-PDD 和 ALA-PDT 效果如何?目前尚没有定论。探讨二者联合运用对脑肿瘤的诊治效果，将有可能为临床诊治脑肿瘤提供新的思路。另一方面，以往对 ALA-PDT 抗肿瘤作用机制的研究主要集中在诱导凋亡和坏死等方面；随着对自噬研究的不断深入，自噬在肿瘤发
4、生、发展以及消亡中的作用越来越受到重视。自噬与凋亡共享着一些调控因子，关系密切；在 ALA-PDT 的基础研究和临床应用中充分认识并且合理协调利用自噬与凋亡抗肿瘤的积极因素，调动肿瘤细胞自身死亡机制，将有助于推动肿瘤光动力治疗研究及其相关学科的共同发展。 为了探讨 ALA 光动力诊断与光动力治疗脑肿瘤的疗效及机制，我们首先制备了兔脑 VX2 转移瘤模型，分别给予 PDD导向显微手术和(或)PDT 后观察实验动物的生存期、MRI 影像及病理学表现，探讨光敏剂 ALA 应用于兔脑 VX2 转移瘤的诊断及治疗效果；然后体外建立大鼠 C6胶质瘤细胞模型，观察不同 ALA 浓度及不同孵育时间 PDT 对
5、 C6 胶质瘤细胞存活率的影响，应用 TUNEL 法测定细胞凋亡率，并通过 MDC 染色和电镜等观察 ALA-PDT 后的自噬现象，探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用；最后，我们分别使用自噬抑制剂 3-MA 和凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 干预后，观察 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞存活率的变化，并检测溶酶体酶 cathepsin B蛋白表达和 Caspase-3 活化，以探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用机制。主要实验结果如下： 1.各实验组(普通光源显微手术组、PDT 组、PDD 组、PDD 导向显微手术
6、+PDT 组)平均生存期均较荷瘤对照组明显延长(Plt;0.01)，而 PDD 导向显微手术+PDT 组荷瘤兔生存期显著长于 PDD 组(Plt;0.05)。MRI 结果显示 PDD 导向显微手术、PDD 导向显微手术+PDT 组较普通光源显微手术组能更彻底切除肿瘤。组织学检查结果显示肿瘤荧光强度较高的区域肿瘤细胞多；荧光微弱的区域散在分布有少许肿瘤细胞，其核分裂像及细胞密度明显降低或接近正常组织，少见异常的血管内皮增生。肿瘤周边区域未见肿瘤细胞；坏死的肿瘤区域没有激发荧光。尸检病理检查提示各手术治疗组肿瘤在原术腔不同程度的复发，复发率分别为：普通光源显微手术组 50(5/10 例)，PDD
7、组 25(5/20 例)；PDD+PDT 组 15(3/20 例)。 2.经 5-ALA 介导的光动力治疗后，C6 胶质瘤细胞的存活率随 5-ALA 的浓度递增逐渐下降，各组之间及各实验组与对照组间均有显著差异，当浓度为 400ug/ml时细胞存活率少于 50。不同 5-ALA 孵育时间的细胞存活率存在显著差异，5-ALA 孵育时间为 6 h 之前，细胞存活率随着孵育时间的延长而下降；超过 6 h后细胞存活率无显著变化。TUNEL 法测定 100g/ml、200g/ml 及400g/ml5-ALA 组 C6 胶质瘤细胞凋亡率分别为 21、49、62。 3.ALA-PDT 后 3 h，MDC 染
8、色 C6 胶质瘤细胞内可见明显的点状荧光颗粒，且随时间逐渐明显增多，24h 时荧光颗粒变弱，而对照组则无此现象。提示 ALA-PDT3 h 时开始出现自噬囊泡，C6 胶质瘤细胞发生自噬；而 PDT 后 12 h，细胞内自噬囊泡数目大量增多，自噬明显活化。透射电镜观察到 ALA-PDT 后 3 h 时，胞浆中即出现大量独立双层膜结构，12 h 时自噬体及其独立双层膜结构相对变少，24 h时观察到典型的凋亡形态，同时仍可见较多的自噬体和独立双层膜结构，及自噬溶酶体的出现。在整个观察中，未见细胞肿胀等坏死形态特征的出现。 4.凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 能减弱 ALA-PDT 对 C6 胶质瘤细
9、胞的生长抑制作用(Plt;0.05)；自噬抑制剂 3-MA 预处理组 C6 胶质瘤细胞生存率显著增加(Plt;0.05)；联合运用 z-VAD-fmk 和 3-MA 时，C6 胶质瘤细胞死亡率明显降低(Plt;0.05)。 5.激光共聚焦显微镜观察到 PDT 后 1 h 时，C6 胶质瘤细胞胞浆内游离 Ca2+荧光强度很弱，此后逐渐增强，6 h 时达最强，12 h 后开始下降；对照组 C6 胶质瘤细胞内 Ca2+荧光微弱；流式细胞仪检测到 ALA-PDT后细胞内钙荧光强度值明显升高。于荧光强度最明显的 20 min 和 6 h 给予 3-MA 干扰后，细胞内平均钙荧光强度值均明显降低，呈显著差
10、异。免疫荧光反应观察到 ALA-PDT 后 1 h 即可见 LC3 荧光分布持续至给药 24 h 时。 6.Western-blot 结果提示 ALA-PDT1 h 时，C6 细胞 cathepsin B 蛋白明显增加，12 h 时达峰值；3-MA 干预后 cathepsin B 表达降低。ALA-PDT 后 1 h C6 胶质瘤细胞内少量 Caspase-3 活化，12 h 时 Caspase-3 酶原表达最高；Ac-DEVD-CHO 干预后 Caspase-3 酶原活化明显减弱。 我们通过观察 5-ALA 介导 PDD 和(或)PDT 治疗兔脑 VX2 肿瘤效果，发现手术治疗和单次 PDT
11、 均能延长 VX2 荷瘤兔的生存期，显微手术与 PDT 等其它疗法相结合后治疗效果增强；PDD 导向显微手术联合 PDT 可快速而高效治疗脑转移瘤。通过观察自噬与凋亡在 PDT 诱导C6 胶质瘤死亡作用的影响，并探讨其机制，明确了 ALA-PDT 对体外培养大鼠 C6胶质瘤细胞有明确杀伤效应，且这种杀伤效应与 5-ALA 浓度、ALA 与细胞孵育时间呈正相关；ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬与凋亡处于动态变化中，早期自噬性保护作用可延迟凋亡的发生，ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬的发生最终有利于抑瘤作用的发挥：在体外条件下 3-MA 可能通过抑制胞内游离钙的升高而削弱 AL
12、A-PDT 诱导的细胞自噬，ALA-PDT 可诱导胞内游离钙升高，这可能与C6 胶质瘤细胞发生自噬有关。为临床 ALA-PDT 治疗脑胶质瘤提供了实验依据。正文内容脑肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病，神经胶质瘤又是颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤有向正常脑组织中侵润性生长的特性，尤其在脑重要功能区及附近时，无法将肿瘤完全切除，术后易复发。放疗、化疗虽可杀伤肿瘤细胞，但同时亦会损伤部分正常脑组织，并可能会出现严重的全身不良反应。近来许多学者将荧光光谱学技术用于肿瘤检测，利用自体荧光或药物荧光的检测方法，可以发现肉眼难以察觉或辨认的微小病变，从而显著提高癌前病变和微小癌的检出率。 光动力诊断(Pho
13、todynamic Diagnosis，PDD)是一种通过以特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应以诊断肿瘤的方法，即输入外源性光敏剂一定时间后，这些光敏物质可以较高的浓度存留在肿瘤组织或肿瘤细胞中，从而与肿瘤周围的正常器官组织形成浓度差，这时如以特定波长的光照射肿瘤部位，就可能激发出特殊形状和强度的光谱图，或在荧光手术显微镜下显色可提示该处可能有肿瘤存在。而光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)则是利用光敏剂和激光活化进行疾病治疗的新方法，其基本原理是肿瘤组织可选择性吸收光敏剂，并在一定时间内肿瘤组织中光敏剂的含量较正常组织多出数 10 倍
14、，此时用特定波长的光源照射肿瘤部位，活化光敏剂，产生光化学反应，损伤多种细胞靶点，破坏肿瘤组织，从而达到选择性治疗肿瘤目的。 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是一种活化光敏剂。研究发现，ALA-PDD 或 ALA-PDT 相对于普通的诊断治疗方法，能明显提高脑肿瘤诊断治疗效果，但联合 ALA-PDD 和 ALA-PDT 效果如何?目前尚没有定论。探讨二者联合运用对脑肿瘤的诊治效果，将有可能为临床诊治脑肿瘤提供新的思路。另一方面，以往对 ALA-PDT 抗肿瘤作用机制的研究主要集中在诱导凋亡和坏死等方面；随着对自噬研究的不断深入，自噬在肿瘤发生、发展以及
15、消亡中的作用越来越受到重视。自噬与凋亡共享着一些调控因子，关系密切；在 ALA-PDT 的基础研究和临床应用中充分认识并且合理协调利用自噬与凋亡抗肿瘤的积极因素，调动肿瘤细胞自身死亡机制，将有助于推动肿瘤光动力治疗研究及其相关学科的共同发展。 为了探讨 ALA 光动力诊断与光动力治疗脑肿瘤的疗效及机制，我们首先制备了兔脑 VX2 转移瘤模型，分别给予 PDD导向显微手术和(或)PDT 后观察实验动物的生存期、MRI 影像及病理学表现，探讨光敏剂 ALA 应用于兔脑 VX2 转移瘤的诊断及治疗效果；然后体外建立大鼠 C6胶质瘤细胞模型，观察不同 ALA 浓度及不同孵育时间 PDT 对 C6 胶质
16、瘤细胞存活率的影响，应用 TUNEL 法测定细胞凋亡率，并通过 MDC 染色和电镜等观察 ALA-PDT 后的自噬现象，探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用；最后，我们分别使用自噬抑制剂 3-MA 和凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 干预后，观察 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞存活率的变化，并检测溶酶体酶 cathepsin B蛋白表达和 Caspase-3 活化，以探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用机制。主要实验结果如下： 1.各实验组(普通光源显微手术组、PDT 组、PDD 组、PDD 导向显微手术+PDT 组
17、)平均生存期均较荷瘤对照组明显延长(Plt;0.01)，而 PDD 导向显微手术+PDT 组荷瘤兔生存期显著长于 PDD 组(Plt;0.05)。MRI 结果显示 PDD 导向显微手术、PDD 导向显微手术+PDT 组较普通光源显微手术组能更彻底切除肿瘤。组织学检查结果显示肿瘤荧光强度较高的区域肿瘤细胞多；荧光微弱的区域散在分布有少许肿瘤细胞，其核分裂像及细胞密度明显降低或接近正常组织，少见异常的血管内皮增生。肿瘤周边区域未见肿瘤细胞；坏死的肿瘤区域没有激发荧光。尸检病理检查提示各手术治疗组肿瘤在原术腔不同程度的复发，复发率分别为：普通光源显微手术组 50(5/10 例)，PDD 组 25(5
18、/20 例)；PDD+PDT 组 15(3/20 例)。 2.经 5-ALA 介导的光动力治疗后，C6 胶质瘤细胞的存活率随 5-ALA 的浓度递增逐渐下降，各组之间及各实验组与对照组间均有显著差异，当浓度为 400ug/ml时细胞存活率少于 50。不同 5-ALA 孵育时间的细胞存活率存在显著差异，5-ALA 孵育时间为 6 h 之前，细胞存活率随着孵育时间的延长而下降；超过 6 h后细胞存活率无显著变化。TUNEL 法测定 100g/ml、200g/ml 及400g/ml5-ALA 组 C6 胶质瘤细胞凋亡率分别为 21、49、62。 3.ALA-PDT 后 3 h，MDC 染色 C6 胶
19、质瘤细胞内可见明显的点状荧光颗粒，且随时间逐渐明显增多，24h 时荧光颗粒变弱，而对照组则无此现象。提示 ALA-PDT3 h 时开始出现自噬囊泡，C6 胶质瘤细胞发生自噬；而 PDT 后 12 h，细胞内自噬囊泡数目大量增多，自噬明显活化。透射电镜观察到 ALA-PDT 后 3 h 时，胞浆中即出现大量独立双层膜结构，12 h 时自噬体及其独立双层膜结构相对变少，24 h时观察到典型的凋亡形态，同时仍可见较多的自噬体和独立双层膜结构，及自噬溶酶体的出现。在整个观察中，未见细胞肿胀等坏死形态特征的出现。 4.凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 能减弱 ALA-PDT 对 C6 胶质瘤细胞的生长抑制
20、作用(Plt;0.05)；自噬抑制剂 3-MA 预处理组 C6 胶质瘤细胞生存率显著增加(Plt;0.05)；联合运用 z-VAD-fmk 和 3-MA 时，C6 胶质瘤细胞死亡率明显降低(Plt;0.05)。 5.激光共聚焦显微镜观察到 PDT 后 1 h 时，C6 胶质瘤细胞胞浆内游离 Ca2+荧光强度很弱，此后逐渐增强，6 h 时达最强，12 h 后开始下降；对照组 C6 胶质瘤细胞内 Ca2+荧光微弱；流式细胞仪检测到 ALA-PDT后细胞内钙荧光强度值明显升高。于荧光强度最明显的 20 min 和 6 h 给予 3-MA 干扰后，细胞内平均钙荧光强度值均明显降低，呈显著差异。免疫荧光
21、反应观察到 ALA-PDT 后 1 h 即可见 LC3 荧光分布持续至给药 24 h 时。 6.Western-blot 结果提示 ALA-PDT1 h 时，C6 细胞 cathepsin B 蛋白明显增加，12 h 时达峰值；3-MA 干预后 cathepsin B 表达降低。ALA-PDT 后 1 h C6 胶质瘤细胞内少量 Caspase-3 活化，12 h 时 Caspase-3 酶原表达最高；Ac-DEVD-CHO 干预后 Caspase-3 酶原活化明显减弱。 我们通过观察 5-ALA 介导 PDD 和(或)PDT 治疗兔脑 VX2 肿瘤效果，发现手术治疗和单次 PDT 均能延长
22、VX2 荷瘤兔的生存期，显微手术与 PDT 等其它疗法相结合后治疗效果增强；PDD 导向显微手术联合 PDT 可快速而高效治疗脑转移瘤。通过观察自噬与凋亡在 PDT 诱导C6 胶质瘤死亡作用的影响，并探讨其机制，明确了 ALA-PDT 对体外培养大鼠 C6胶质瘤细胞有明确杀伤效应，且这种杀伤效应与 5-ALA 浓度、ALA 与细胞孵育时间呈正相关；ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬与凋亡处于动态变化中，早期自噬性保护作用可延迟凋亡的发生，ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬的发生最终有利于抑瘤作用的发挥：在体外条件下 3-MA 可能通过抑制胞内游离钙的升高而削弱 ALA-PDT
23、诱导的细胞自噬，ALA-PDT 可诱导胞内游离钙升高，这可能与C6 胶质瘤细胞发生自噬有关。为临床 ALA-PDT 治疗脑胶质瘤提供了实验依据。脑肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病，神经胶质瘤又是颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤有向正常脑组织中侵润性生长的特性，尤其在脑重要功能区及附近时，无法将肿瘤完全切除，术后易复发。放疗、化疗虽可杀伤肿瘤细胞，但同时亦会损伤部分正常脑组织，并可能会出现严重的全身不良反应。近来许多学者将荧光光谱学技术用于肿瘤检测，利用自体荧光或药物荧光的检测方法，可以发现肉眼难以察觉或辨认的微小病变，从而显著提高癌前病变和微小癌的检出率。 光动力诊断(Photodynamic
24、Diagnosis，PDD)是一种通过以特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应以诊断肿瘤的方法，即输入外源性光敏剂一定时间后，这些光敏物质可以较高的浓度存留在肿瘤组织或肿瘤细胞中，从而与肿瘤周围的正常器官组织形成浓度差，这时如以特定波长的光照射肿瘤部位，就可能激发出特殊形状和强度的光谱图，或在荧光手术显微镜下显色可提示该处可能有肿瘤存在。而光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)则是利用光敏剂和激光活化进行疾病治疗的新方法，其基本原理是肿瘤组织可选择性吸收光敏剂，并在一定时间内肿瘤组织中光敏剂的含量较正常组织多出数 10 倍，此时用特定波长的光
25、源照射肿瘤部位，活化光敏剂，产生光化学反应，损伤多种细胞靶点，破坏肿瘤组织，从而达到选择性治疗肿瘤目的。 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是一种活化光敏剂。研究发现，ALA-PDD 或 ALA-PDT 相对于普通的诊断治疗方法，能明显提高脑肿瘤诊断治疗效果，但联合 ALA-PDD 和 ALA-PDT 效果如何?目前尚没有定论。探讨二者联合运用对脑肿瘤的诊治效果，将有可能为临床诊治脑肿瘤提供新的思路。另一方面，以往对 ALA-PDT 抗肿瘤作用机制的研究主要集中在诱导凋亡和坏死等方面；随着对自噬研究的不断深入，自噬在肿瘤发生、发展以及消亡中的作用越来越受
26、到重视。自噬与凋亡共享着一些调控因子，关系密切；在 ALA-PDT 的基础研究和临床应用中充分认识并且合理协调利用自噬与凋亡抗肿瘤的积极因素，调动肿瘤细胞自身死亡机制，将有助于推动肿瘤光动力治疗研究及其相关学科的共同发展。 为了探讨 ALA 光动力诊断与光动力治疗脑肿瘤的疗效及机制，我们首先制备了兔脑 VX2 转移瘤模型，分别给予 PDD导向显微手术和(或)PDT 后观察实验动物的生存期、MRI 影像及病理学表现，探讨光敏剂 ALA 应用于兔脑 VX2 转移瘤的诊断及治疗效果；然后体外建立大鼠 C6胶质瘤细胞模型，观察不同 ALA 浓度及不同孵育时间 PDT 对 C6 胶质瘤细胞存活率的影响，
27、应用 TUNEL 法测定细胞凋亡率，并通过 MDC 染色和电镜等观察 ALA-PDT 后的自噬现象，探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用；最后，我们分别使用自噬抑制剂 3-MA 和凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 干预后，观察 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞存活率的变化，并检测溶酶体酶 cathepsin B蛋白表达和 Caspase-3 活化，以探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用机制。主要实验结果如下： 1.各实验组(普通光源显微手术组、PDT 组、PDD 组、PDD 导向显微手术+PDT 组)平均生存期均较荷瘤
28、对照组明显延长(Plt;0.01)，而 PDD 导向显微手术+PDT 组荷瘤兔生存期显著长于 PDD 组(Plt;0.05)。MRI 结果显示 PDD 导向显微手术、PDD 导向显微手术+PDT 组较普通光源显微手术组能更彻底切除肿瘤。组织学检查结果显示肿瘤荧光强度较高的区域肿瘤细胞多；荧光微弱的区域散在分布有少许肿瘤细胞，其核分裂像及细胞密度明显降低或接近正常组织，少见异常的血管内皮增生。肿瘤周边区域未见肿瘤细胞；坏死的肿瘤区域没有激发荧光。尸检病理检查提示各手术治疗组肿瘤在原术腔不同程度的复发，复发率分别为：普通光源显微手术组 50(5/10 例)，PDD 组 25(5/20 例)；PDD
29、+PDT 组 15(3/20 例)。 2.经 5-ALA 介导的光动力治疗后，C6 胶质瘤细胞的存活率随 5-ALA 的浓度递增逐渐下降，各组之间及各实验组与对照组间均有显著差异，当浓度为 400ug/ml时细胞存活率少于 50。不同 5-ALA 孵育时间的细胞存活率存在显著差异，5-ALA 孵育时间为 6 h 之前，细胞存活率随着孵育时间的延长而下降；超过 6 h后细胞存活率无显著变化。TUNEL 法测定 100g/ml、200g/ml 及400g/ml5-ALA 组 C6 胶质瘤细胞凋亡率分别为 21、49、62。 3.ALA-PDT 后 3 h，MDC 染色 C6 胶质瘤细胞内可见明显的
30、点状荧光颗粒，且随时间逐渐明显增多，24h 时荧光颗粒变弱，而对照组则无此现象。提示 ALA-PDT3 h 时开始出现自噬囊泡，C6 胶质瘤细胞发生自噬；而 PDT 后 12 h，细胞内自噬囊泡数目大量增多，自噬明显活化。透射电镜观察到 ALA-PDT 后 3 h 时，胞浆中即出现大量独立双层膜结构，12 h 时自噬体及其独立双层膜结构相对变少，24 h时观察到典型的凋亡形态，同时仍可见较多的自噬体和独立双层膜结构，及自噬溶酶体的出现。在整个观察中，未见细胞肿胀等坏死形态特征的出现。 4.凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 能减弱 ALA-PDT 对 C6 胶质瘤细胞的生长抑制作用(Plt;0.0
31、5)；自噬抑制剂 3-MA 预处理组 C6 胶质瘤细胞生存率显著增加(Plt;0.05)；联合运用 z-VAD-fmk 和 3-MA 时，C6 胶质瘤细胞死亡率明显降低(Plt;0.05)。 5.激光共聚焦显微镜观察到 PDT 后 1 h 时，C6 胶质瘤细胞胞浆内游离 Ca2+荧光强度很弱，此后逐渐增强，6 h 时达最强，12 h 后开始下降；对照组 C6 胶质瘤细胞内 Ca2+荧光微弱；流式细胞仪检测到 ALA-PDT后细胞内钙荧光强度值明显升高。于荧光强度最明显的 20 min 和 6 h 给予 3-MA 干扰后，细胞内平均钙荧光强度值均明显降低，呈显著差异。免疫荧光反应观察到 ALA-
32、PDT 后 1 h 即可见 LC3 荧光分布持续至给药 24 h 时。 6.Western-blot 结果提示 ALA-PDT1 h 时，C6 细胞 cathepsin B 蛋白明显增加，12 h 时达峰值；3-MA 干预后 cathepsin B 表达降低。ALA-PDT 后 1 h C6 胶质瘤细胞内少量 Caspase-3 活化，12 h 时 Caspase-3 酶原表达最高；Ac-DEVD-CHO 干预后 Caspase-3 酶原活化明显减弱。 我们通过观察 5-ALA 介导 PDD 和(或)PDT 治疗兔脑 VX2 肿瘤效果，发现手术治疗和单次 PDT 均能延长 VX2 荷瘤兔的生存
33、期，显微手术与 PDT 等其它疗法相结合后治疗效果增强；PDD 导向显微手术联合 PDT 可快速而高效治疗脑转移瘤。通过观察自噬与凋亡在 PDT 诱导C6 胶质瘤死亡作用的影响，并探讨其机制，明确了 ALA-PDT 对体外培养大鼠 C6胶质瘤细胞有明确杀伤效应，且这种杀伤效应与 5-ALA 浓度、ALA 与细胞孵育时间呈正相关；ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬与凋亡处于动态变化中，早期自噬性保护作用可延迟凋亡的发生，ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬的发生最终有利于抑瘤作用的发挥：在体外条件下 3-MA 可能通过抑制胞内游离钙的升高而削弱 ALA-PDT 诱导的细胞自噬，AL
34、A-PDT 可诱导胞内游离钙升高，这可能与C6 胶质瘤细胞发生自噬有关。为临床 ALA-PDT 治疗脑胶质瘤提供了实验依据。脑肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病，神经胶质瘤又是颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤有向正常脑组织中侵润性生长的特性，尤其在脑重要功能区及附近时，无法将肿瘤完全切除，术后易复发。放疗、化疗虽可杀伤肿瘤细胞，但同时亦会损伤部分正常脑组织，并可能会出现严重的全身不良反应。近来许多学者将荧光光谱学技术用于肿瘤检测，利用自体荧光或药物荧光的检测方法，可以发现肉眼难以察觉或辨认的微小病变，从而显著提高癌前病变和微小癌的检出率。 光动力诊断(Photodynamic Diagnosis，
35、PDD)是一种通过以特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应以诊断肿瘤的方法，即输入外源性光敏剂一定时间后，这些光敏物质可以较高的浓度存留在肿瘤组织或肿瘤细胞中，从而与肿瘤周围的正常器官组织形成浓度差，这时如以特定波长的光照射肿瘤部位，就可能激发出特殊形状和强度的光谱图，或在荧光手术显微镜下显色可提示该处可能有肿瘤存在。而光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)则是利用光敏剂和激光活化进行疾病治疗的新方法，其基本原理是肿瘤组织可选择性吸收光敏剂，并在一定时间内肿瘤组织中光敏剂的含量较正常组织多出数 10 倍，此时用特定波长的光源照射肿瘤部位，活化
36、光敏剂，产生光化学反应，损伤多种细胞靶点，破坏肿瘤组织，从而达到选择性治疗肿瘤目的。 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是一种活化光敏剂。研究发现，ALA-PDD 或 ALA-PDT 相对于普通的诊断治疗方法，能明显提高脑肿瘤诊断治疗效果，但联合 ALA-PDD 和 ALA-PDT 效果如何?目前尚没有定论。探讨二者联合运用对脑肿瘤的诊治效果，将有可能为临床诊治脑肿瘤提供新的思路。另一方面，以往对 ALA-PDT 抗肿瘤作用机制的研究主要集中在诱导凋亡和坏死等方面；随着对自噬研究的不断深入，自噬在肿瘤发生、发展以及消亡中的作用越来越受到重视。自噬与凋亡共
37、享着一些调控因子，关系密切；在 ALA-PDT 的基础研究和临床应用中充分认识并且合理协调利用自噬与凋亡抗肿瘤的积极因素，调动肿瘤细胞自身死亡机制，将有助于推动肿瘤光动力治疗研究及其相关学科的共同发展。 为了探讨 ALA 光动力诊断与光动力治疗脑肿瘤的疗效及机制，我们首先制备了兔脑 VX2 转移瘤模型，分别给予 PDD导向显微手术和(或)PDT 后观察实验动物的生存期、MRI 影像及病理学表现，探讨光敏剂 ALA 应用于兔脑 VX2 转移瘤的诊断及治疗效果；然后体外建立大鼠 C6胶质瘤细胞模型，观察不同 ALA 浓度及不同孵育时间 PDT 对 C6 胶质瘤细胞存活率的影响，应用 TUNEL 法
38、测定细胞凋亡率，并通过 MDC 染色和电镜等观察 ALA-PDT 后的自噬现象，探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用；最后，我们分别使用自噬抑制剂 3-MA 和凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 干预后，观察 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞存活率的变化，并检测溶酶体酶 cathepsin B蛋白表达和 Caspase-3 活化，以探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用机制。主要实验结果如下： 1.各实验组(普通光源显微手术组、PDT 组、PDD 组、PDD 导向显微手术+PDT 组)平均生存期均较荷瘤对照组明显延长(Pl
39、t;0.01)，而 PDD 导向显微手术+PDT 组荷瘤兔生存期显著长于 PDD 组(Plt;0.05)。MRI 结果显示 PDD 导向显微手术、PDD 导向显微手术+PDT 组较普通光源显微手术组能更彻底切除肿瘤。组织学检查结果显示肿瘤荧光强度较高的区域肿瘤细胞多；荧光微弱的区域散在分布有少许肿瘤细胞，其核分裂像及细胞密度明显降低或接近正常组织，少见异常的血管内皮增生。肿瘤周边区域未见肿瘤细胞；坏死的肿瘤区域没有激发荧光。尸检病理检查提示各手术治疗组肿瘤在原术腔不同程度的复发，复发率分别为：普通光源显微手术组 50(5/10 例)，PDD 组 25(5/20 例)；PDD+PDT 组 15(
40、3/20 例)。 2.经 5-ALA 介导的光动力治疗后，C6 胶质瘤细胞的存活率随 5-ALA 的浓度递增逐渐下降，各组之间及各实验组与对照组间均有显著差异，当浓度为 400ug/ml时细胞存活率少于 50。不同 5-ALA 孵育时间的细胞存活率存在显著差异，5-ALA 孵育时间为 6 h 之前，细胞存活率随着孵育时间的延长而下降；超过 6 h后细胞存活率无显著变化。TUNEL 法测定 100g/ml、200g/ml 及400g/ml5-ALA 组 C6 胶质瘤细胞凋亡率分别为 21、49、62。 3.ALA-PDT 后 3 h，MDC 染色 C6 胶质瘤细胞内可见明显的点状荧光颗粒，且随时
41、间逐渐明显增多，24h 时荧光颗粒变弱，而对照组则无此现象。提示 ALA-PDT3 h 时开始出现自噬囊泡，C6 胶质瘤细胞发生自噬；而 PDT 后 12 h，细胞内自噬囊泡数目大量增多，自噬明显活化。透射电镜观察到 ALA-PDT 后 3 h 时，胞浆中即出现大量独立双层膜结构，12 h 时自噬体及其独立双层膜结构相对变少，24 h时观察到典型的凋亡形态，同时仍可见较多的自噬体和独立双层膜结构，及自噬溶酶体的出现。在整个观察中，未见细胞肿胀等坏死形态特征的出现。 4.凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 能减弱 ALA-PDT 对 C6 胶质瘤细胞的生长抑制作用(Plt;0.05)；自噬抑制剂 3
42、-MA 预处理组 C6 胶质瘤细胞生存率显著增加(Plt;0.05)；联合运用 z-VAD-fmk 和 3-MA 时，C6 胶质瘤细胞死亡率明显降低(Plt;0.05)。 5.激光共聚焦显微镜观察到 PDT 后 1 h 时，C6 胶质瘤细胞胞浆内游离 Ca2+荧光强度很弱，此后逐渐增强，6 h 时达最强，12 h 后开始下降；对照组 C6 胶质瘤细胞内 Ca2+荧光微弱；流式细胞仪检测到 ALA-PDT后细胞内钙荧光强度值明显升高。于荧光强度最明显的 20 min 和 6 h 给予 3-MA 干扰后，细胞内平均钙荧光强度值均明显降低，呈显著差异。免疫荧光反应观察到 ALA-PDT 后 1 h
43、即可见 LC3 荧光分布持续至给药 24 h 时。 6.Western-blot 结果提示 ALA-PDT1 h 时，C6 细胞 cathepsin B 蛋白明显增加，12 h 时达峰值；3-MA 干预后 cathepsin B 表达降低。ALA-PDT 后 1 h C6 胶质瘤细胞内少量 Caspase-3 活化，12 h 时 Caspase-3 酶原表达最高；Ac-DEVD-CHO 干预后 Caspase-3 酶原活化明显减弱。 我们通过观察 5-ALA 介导 PDD 和(或)PDT 治疗兔脑 VX2 肿瘤效果，发现手术治疗和单次 PDT 均能延长 VX2 荷瘤兔的生存期，显微手术与 PD
44、T 等其它疗法相结合后治疗效果增强；PDD 导向显微手术联合 PDT 可快速而高效治疗脑转移瘤。通过观察自噬与凋亡在 PDT 诱导C6 胶质瘤死亡作用的影响，并探讨其机制，明确了 ALA-PDT 对体外培养大鼠 C6胶质瘤细胞有明确杀伤效应，且这种杀伤效应与 5-ALA 浓度、ALA 与细胞孵育时间呈正相关；ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬与凋亡处于动态变化中，早期自噬性保护作用可延迟凋亡的发生，ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞自噬的发生最终有利于抑瘤作用的发挥：在体外条件下 3-MA 可能通过抑制胞内游离钙的升高而削弱 ALA-PDT 诱导的细胞自噬，ALA-PDT 可诱导胞
45、内游离钙升高，这可能与C6 胶质瘤细胞发生自噬有关。为临床 ALA-PDT 治疗脑胶质瘤提供了实验依据。脑肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病，神经胶质瘤又是颅内最常见的恶性肿瘤。胶质瘤有向正常脑组织中侵润性生长的特性，尤其在脑重要功能区及附近时，无法将肿瘤完全切除，术后易复发。放疗、化疗虽可杀伤肿瘤细胞，但同时亦会损伤部分正常脑组织，并可能会出现严重的全身不良反应。近来许多学者将荧光光谱学技术用于肿瘤检测，利用自体荧光或药物荧光的检测方法，可以发现肉眼难以察觉或辨认的微小病变，从而显著提高癌前病变和微小癌的检出率。 光动力诊断(Photodynamic Diagnosis，PDD)是一种通过以
46、特定波长的光照射一定的光敏物质后产生的一系列化学、物理、生物等反应以诊断肿瘤的方法，即输入外源性光敏剂一定时间后，这些光敏物质可以较高的浓度存留在肿瘤组织或肿瘤细胞中，从而与肿瘤周围的正常器官组织形成浓度差，这时如以特定波长的光照射肿瘤部位，就可能激发出特殊形状和强度的光谱图，或在荧光手术显微镜下显色可提示该处可能有肿瘤存在。而光动力治疗(Photodynamic Therapy，PDT)则是利用光敏剂和激光活化进行疾病治疗的新方法，其基本原理是肿瘤组织可选择性吸收光敏剂，并在一定时间内肿瘤组织中光敏剂的含量较正常组织多出数 10 倍，此时用特定波长的光源照射肿瘤部位，活化光敏剂，产生光化学反
47、应，损伤多种细胞靶点，破坏肿瘤组织，从而达到选择性治疗肿瘤目的。 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)是一种活化光敏剂。研究发现，ALA-PDD 或 ALA-PDT 相对于普通的诊断治疗方法，能明显提高脑肿瘤诊断治疗效果，但联合 ALA-PDD 和 ALA-PDT 效果如何?目前尚没有定论。探讨二者联合运用对脑肿瘤的诊治效果，将有可能为临床诊治脑肿瘤提供新的思路。另一方面，以往对 ALA-PDT 抗肿瘤作用机制的研究主要集中在诱导凋亡和坏死等方面；随着对自噬研究的不断深入，自噬在肿瘤发生、发展以及消亡中的作用越来越受到重视。自噬与凋亡共享着一些调控因子，关
48、系密切；在 ALA-PDT 的基础研究和临床应用中充分认识并且合理协调利用自噬与凋亡抗肿瘤的积极因素，调动肿瘤细胞自身死亡机制，将有助于推动肿瘤光动力治疗研究及其相关学科的共同发展。 为了探讨 ALA 光动力诊断与光动力治疗脑肿瘤的疗效及机制，我们首先制备了兔脑 VX2 转移瘤模型，分别给予 PDD导向显微手术和(或)PDT 后观察实验动物的生存期、MRI 影像及病理学表现，探讨光敏剂 ALA 应用于兔脑 VX2 转移瘤的诊断及治疗效果；然后体外建立大鼠 C6胶质瘤细胞模型，观察不同 ALA 浓度及不同孵育时间 PDT 对 C6 胶质瘤细胞存活率的影响，应用 TUNEL 法测定细胞凋亡率，并通
49、过 MDC 染色和电镜等观察 ALA-PDT 后的自噬现象，探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用；最后，我们分别使用自噬抑制剂 3-MA 和凋亡抑制剂 z-VAD-fmk 干预后，观察 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞存活率的变化，并检测溶酶体酶 cathepsin B蛋白表达和 Caspase-3 活化，以探讨自噬与凋亡机制在 ALA-PDT 诱导 C6 胶质瘤细胞死亡中的作用机制。主要实验结果如下： 1.各实验组(普通光源显微手术组、PDT 组、PDD 组、PDD 导向显微手术+PDT 组)平均生存期均较荷瘤对照组明显延长(Plt;0.01)，而 PDD 导向显微手术+PDT 组荷瘤兔生存期显著长于 PDD 组(Plt;0.05)。MRI 结果显示 PDD 导向显微手术、PDD 导向显微手术+PDT 组较普通光源显微手术组能更彻底切除肿瘤。组织学检查结果显示肿瘤荧光强度较高的区域肿瘤细胞多；荧光微弱的区域散在分布有少许肿瘤细胞，其核分裂像及细胞密度明显降低或接近正常组织，少见异常的血管内皮增生。肿瘤周边区域未见肿瘤细胞；坏死的肿瘤区域没有激发荧光。尸检病理检查提示各手术治
