1、外科学 整形外科专业毕业论文 精品论文 VEGF 和 HO-1 联合应用提高超长随意皮瓣末端存活率的实验研究关键词：血管内皮生长因子 血红素氧合酶 非增殖腺病毒 基因转染 BJ 细胞摘要：随意皮瓣是修复创面、重建功能、改善外形常用的皮瓣。但临床应用时往往受到严格的长宽比例的限制。临床上超过一定长宽比例的皮瓣远端常发生缺血坏死，目前尚无公认的最佳改善皮瓣存活的方法。皮瓣移植成功与两个因素有关：一是蒂部及血管网的血供营养，二是皮瓣基底及周边组织床新生微血管的及时长入。因此在蒂部血流一定的条件下，如何促进血管新生成为提高皮瓣存活面积一个关键因素。新生血管的及时形成对皮瓣的成活起着很重要的作用，如果阻
2、断皮瓣与受床之间血运的建立，皮瓣的成活面积将减少。皮瓣远端缺血部分的成活过程与皮片相同，主要通过与受床间建立血运再血管化而成活。在目前众多的研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)是一种有效的促血管新生因子，它能刺激血管内皮细胞有丝分裂和增加血管内皮细胞渗透性促进血管生成，诱导 NO 的生成1，进而起到促进组织愈合的作用。VEGF 有良好的生物学作用已经得到认可，很多学者也尝试了用各种不同的方法和途径通过外源性的 VEGF作为补充来促进皮瓣的成活。组织在缺血后发生一系列的生物反应，组织的缺血引起 VEGF 浓度的升高，改变皮瓣的灌注，从而引起血管的舒张和新生血管的形成2，3。然而，由于皮瓣远端组
3、织长时间严重的缺氧、缺血会使微血管及内皮细胞会受到直接损伤，使得内源性的 VEGF 来不及分泌，或在外源性的VEGF 补充后远端组织的新生血管不能及时长入而导致坏死。在缺血后 3h，我们就可以检测到 VEGF 受体 VEGFR-2 的表达，而在 18h 后就会发生衰减4。因此，我们在本实验中在使用 VEGF 的同时，联合引进了具有抗氧化，抗炎症，抗凋亡，可以提高机体抗缺氧能力的血红素氧化酶(HO-1)5。此酶能够延长随意皮瓣远端组织的抗缺氧时间，为 VEGF 促进新生血管的长入赢得了更加充足的时间，从而提高超长随意皮瓣远端组织的存活面积。 HO-1 是血红素代谢的起始限速酶，主要存在于细胞微粒
4、体中。它能够将血红素分解为胆绿素、一氧化碳和铁6，7，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下进一步生成胆红素。胆红素和胆绿素能有效的清除氧自由基，有较强的抗氧化功能。在许多因素作用下能诱导产生HO-1 表达，是细胞在缺血再灌注8、低氧损伤、内毒素血症9、组织排异10等应激过程中的一种自我保护机制。Bussolati 等11提出 VEGF 诱导 HO-1的表达，提高了 HO-1 在人内皮细胞中的活性。HO-1 抑制剂能够消除 VEGF 在体内非炎症的促血管新生反应。先前的体外实验证实了 HO-1 能诱导 VEGF 的分泌，HO-1 的大量表达会引起毛细血管样结构的增殖和形成12，13。Soares 等14
5、研究发现，VEGF 和 HO-1 的表达会激发一个正反馈环的形成，即 VEGF 可以上调HO-1 的表达，反之亦然。 基因表达载体有病毒表达载体和非病毒表达载体。病毒表达载体有 RNA 逆转录病毒、DNA 腺病毒和 DNA 腺相关病毒( AAY)等；而非病毒表达载体有质粒、脂质体、裸 DNA 和基因枪等。目前被研究应用最多也最方便的是腺病毒载体。腺病毒载体的优点有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；不整合到染色体中，无插入致突变性；能同时表达多个基因等。正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个
6、领域。 在本实验中，我们将 VEGF 和 HO-1 有机的结合在一起，使其两者发挥更大的生物学效应。并以腺病毒为载体转染靶细胞，使其能持续表达目的蛋白，有助于克服传统的生物制剂半衰期短，活性低，成本高等缺点。以腺病毒在载体联合应用 VEGF 和 HO-1 能否提高随意皮瓣远端组织的成活面积，目前国内外未见相关报道。为此，我们设计了本实验课题，进行了以下三个部分的实验研究。 1Ad5-VEGF 和 Ad5-HO-1 非增殖腺病毒的构建与制备 目的：构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)和血红素氧合酶(HO-1)的重组腺病毒载体(Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1)，为后续的基因转染
7、、体内实验提供实验基础。 方法：引物合成后获取目的基因，将质粒 PDC315-VEGF 和 PSUCMV-HO-1与含有 5 型腺病毒右臂的质粒 pBHGE3 通过 Lipofectamine2000 共转染至 293 细胞。共转染后 9-14 天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒 DNA并应用 PCR 进行鉴定。将重组出的病毒在 293 细胞中反复大量扩增，通过氯化铯密度梯度离心法进行纯化，并用 TCID50 法计算病毒滴度。 结果：经鉴定正确的腺病毒命名为 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1。测得重组腺病毒 Ad-VEGF 滴度为110m pfu/ml，病毒 Ad-Ho-
8、1 滴度为 7.5109 pfu/ml。结论：成功构建了复制缺陷型重组腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其滴度高，毒性低，可用于体外转染。 2腺病毒 Ad-VEGF 和 Ad-HO 的体外实验研究 目的：探讨重组腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1 转染成纤维细胞 BJ 后目的蛋白的表达情况和对 BJ 细胞生长、增殖分化的影响。 方法：用报告基因 Ad-EGFP 转染靶细胞，观察其在荧光显微镜下的荧光强度和流式细胞仪来检测腺病毒的转染效率和强度。用ELISA 的方法检测 Ad-VEGF165 在 BJ 细胞中定量表达，用免疫组化和 WESTERN BLOT 检测 A
9、d-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达情况。MTT 检测腺病毒对 BJ 细胞增殖活性的影响。 结果：腺病毒介导的目的基因对 BJ 细胞有较高的转染效率，随着 MOI 的增强效率增高，具有量效关系。ELISA 可以检测到 VEGF 的有效表达，同时免疫组化和 WESTERN BLDT 也检测到了 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达。转染一周后 MTT 检测 OD 值，转染组细胞与未转染组细胞的 OD 值无显著性差异。结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 能在 BJ 细胞中有效表达，并且不会对BJ 细胞的增殖活性产生影响。 3Ad-VEGF 和 Ad-HO 联合应用提高大鼠超
10、长皮瓣存活率的体内实验研究 目的：探讨腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能否提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积。 方法：以 SD 大鼠背部两侧超长随意皮瓣为模型15。将动物随机分为 5 组：Ad-VEGF165+Ad-HO-1(A 组)、Ad-VEGF165(B 组)、Ad-HO-1(C 组)、Ad-GFP(D 组)、病毒保存液 Ad-buffer(E 组)。分别在掀起皮瓣深筋膜层分 10 小部分注射。术后一周采用颈椎脱臼法处死。观察各个皮瓣的大体情况，存活面积，常规病理切片 HE 染色，皮瓣组织的 VEGF 和 HO-1 免疫组化检测，CD31 免疫组化和皮瓣新生微血管
11、密度(MVD)计数，进行统计学分析。 结果：大体解剖及病理切片显示：Ad-VEGF165+Ad-HO-1 联合应用组皮瓣的成活面积及血管化程度明显高于其他四组，B 组稍高于 C、D、E 三组，C、D、E 三组之间无明显差异(P0.05)。 结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能够提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积，降低皮瓣覆盖创面的风险。 综上所述，我们构建了携带 VEGF165和 HO-1 目的基因的非增殖腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其对提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积的疗效明显强于传统治疗。该方案充分发挥了HO-1 的抗缺氧、抗凋亡、抗
12、炎症的能力和 VEGF165 的协同作用，为提高皮瓣的长宽比和成活率提供了新的临床治疗策率和新的思路。正文内容随意皮瓣是修复创面、重建功能、改善外形常用的皮瓣。但临床应用时往往受到严格的长宽比例的限制。临床上超过一定长宽比例的皮瓣远端常发生缺血坏死，目前尚无公认的最佳改善皮瓣存活的方法。皮瓣移植成功与两个因素有关：一是蒂部及血管网的血供营养，二是皮瓣基底及周边组织床新生微血管的及时长入。因此在蒂部血流一定的条件下，如何促进血管新生成为提高皮瓣存活面积一个关键因素。新生血管的及时形成对皮瓣的成活起着很重要的作用，如果阻断皮瓣与受床之间血运的建立，皮瓣的成活面积将减少。皮瓣远端缺血部分的成活过程与
13、皮片相同，主要通过与受床间建立血运再血管化而成活。在目前众多的研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)是一种有效的促血管新生因子，它能刺激血管内皮细胞有丝分裂和增加血管内皮细胞渗透性促进血管生成，诱导 NO 的生成1，进而起到促进组织愈合的作用。VEGF 有良好的生物学作用已经得到认可，很多学者也尝试了用各种不同的方法和途径通过外源性的 VEGF 作为补充来促进皮瓣的成活。组织在缺血后发生一系列的生物反应，组织的缺血引起 VEGF 浓度的升高，改变皮瓣的灌注，从而引起血管的舒张和新生血管的形成2，3。然而，由于皮瓣远端组织长时间严重的缺氧、缺血会使微血管及内皮细胞会受到直接损伤，使得内源性的 V
14、EGF 来不及分泌，或在外源性的 VEGF补充后远端组织的新生血管不能及时长入而导致坏死。在缺血后 3h，我们就可以检测到 VEGF 受体 VEGFR-2 的表达，而在 18h 后就会发生衰减4。因此，我们在本实验中在使用 VEGF 的同时，联合引进了具有抗氧化，抗炎症，抗凋亡，可以提高机体抗缺氧能力的血红素氧化酶(HO-1)5。此酶能够延长随意皮瓣远端组织的抗缺氧时间，为 VEGF 促进新生血管的长入赢得了更加充足的时间，从而提高超长随意皮瓣远端组织的存活面积。 HO-1 是血红素代谢的起始限速酶，主要存在于细胞微粒体中。它能够将血红素分解为胆绿素、一氧化碳和铁6，7，胆绿素在胆绿素还原酶的
15、作用下进一步生成胆红素。胆红素和胆绿素能有效的清除氧自由基，有较强的抗氧化功能。在许多因素作用下能诱导产生HO-1 表达，是细胞在缺血再灌注8、低氧损伤、内毒素血症9、组织排异10等应激过程中的一种自我保护机制。Bussolati 等11提出 VEGF 诱导 HO-1的表达，提高了 HO-1 在人内皮细胞中的活性。HO-1 抑制剂能够消除 VEGF 在体内非炎症的促血管新生反应。先前的体外实验证实了 HO-1 能诱导 VEGF 的分泌，HO-1 的大量表达会引起毛细血管样结构的增殖和形成12，13。Soares 等14研究发现，VEGF 和 HO-1 的表达会激发一个正反馈环的形成，即 VEG
16、F 可以上调HO-1 的表达，反之亦然。 基因表达载体有病毒表达载体和非病毒表达载体。病毒表达载体有 RNA 逆转录病毒、DNA 腺病毒和 DNA 腺相关病毒( AAY)等；而非病毒表达载体有质粒、脂质体、裸 DNA 和基因枪等。目前被研究应用最多也最方便的是腺病毒载体。腺病毒载体的优点有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；不整合到染色体中，无插入致突变性；能同时表达多个基因等。正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。 在本实验中，我们将 VEGF 和 HO-1 有机的结合在一起，使其两
17、者发挥更大的生物学效应。并以腺病毒为载体转染靶细胞，使其能持续表达目的蛋白，有助于克服传统的生物制剂半衰期短，活性低，成本高等缺点。以腺病毒在载体联合应用 VEGF 和 HO-1 能否提高随意皮瓣远端组织的成活面积，目前国内外未见相关报道。为此，我们设计了本实验课题，进行了以下三个部分的实验研究。 1Ad5-VEGF 和 Ad5-HO-1 非增殖腺病毒的构建与制备 目的：构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)和血红素氧合酶(HO-1)的重组腺病毒载体(Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1)，为后续的基因转染、体内实验提供实验基础。 方法：引物合成后获取目的基因，将质粒 PDC315
18、-VEGF 和 PSUCMV-HO-1与含有 5 型腺病毒右臂的质粒 pBHGE3 通过 Lipofectamine2000 共转染至 293 细胞。共转染后 9-14 天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒 DNA并应用 PCR 进行鉴定。将重组出的病毒在 293 细胞中反复大量扩增，通过氯化铯密度梯度离心法进行纯化，并用 TCID50 法计算病毒滴度。 结果：经鉴定正确的腺病毒命名为 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1。测得重组腺病毒 Ad-VEGF 滴度为110m pfu/ml，病毒 Ad-Ho-1 滴度为 7.5109 pfu/ml。结论：成功构建了复制缺陷型重组腺病毒
19、 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其滴度高，毒性低，可用于体外转染。 2腺病毒 Ad-VEGF 和 Ad-HO 的体外实验研究 目的：探讨重组腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1 转染成纤维细胞 BJ 后目的蛋白的表达情况和对 BJ 细胞生长、增殖分化的影响。 方法：用报告基因 Ad-EGFP 转染靶细胞，观察其在荧光显微镜下的荧光强度和流式细胞仪来检测腺病毒的转染效率和强度。用ELISA 的方法检测 Ad-VEGF165 在 BJ 细胞中定量表达，用免疫组化和 WESTERN BLOT 检测 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达情况。MTT 检测腺病毒对 BJ 细
20、胞增殖活性的影响。 结果：腺病毒介导的目的基因对 BJ 细胞有较高的转染效率，随着 MOI 的增强效率增高，具有量效关系。ELISA 可以检测到 VEGF 的有效表达，同时免疫组化和 WESTERN BLDT 也检测到了 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达。转染一周后 MTT 检测 OD 值，转染组细胞与未转染组细胞的 OD 值无显著性差异。结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 能在 BJ 细胞中有效表达，并且不会对BJ 细胞的增殖活性产生影响。 3Ad-VEGF 和 Ad-HO 联合应用提高大鼠超长皮瓣存活率的体内实验研究 目的：探讨腺病毒介导的 VEGF165 和 HO
21、-1 联合应用能否提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积。 方法：以 SD 大鼠背部两侧超长随意皮瓣为模型15。将动物随机分为 5 组：Ad-VEGF165+Ad-HO-1(A 组)、Ad-VEGF165(B 组)、Ad-HO-1(C 组)、Ad-GFP(D 组)、病毒保存液 Ad-buffer(E 组)。分别在掀起皮瓣深筋膜层分 10 小部分注射。术后一周采用颈椎脱臼法处死。观察各个皮瓣的大体情况，存活面积，常规病理切片 HE 染色，皮瓣组织的 VEGF 和 HO-1 免疫组化检测，CD31 免疫组化和皮瓣新生微血管密度(MVD)计数，进行统计学分析。 结果：大体解剖及病理切片显示：Ad-V
22、EGF165+Ad-HO-1 联合应用组皮瓣的成活面积及血管化程度明显高于其他四组，B 组稍高于 C、D、E 三组，C、D、E 三组之间无明显差异(P0.05)。 结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能够提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积，降低皮瓣覆盖创面的风险。 综上所述，我们构建了携带 VEGF165和 HO-1 目的基因的非增殖腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其对提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积的疗效明显强于传统治疗。该方案充分发挥了HO-1 的抗缺氧、抗凋亡、抗炎症的能力和 VEGF165 的协同作用，为提高皮瓣的长宽比和成活率提供了新
23、的临床治疗策率和新的思路。随意皮瓣是修复创面、重建功能、改善外形常用的皮瓣。但临床应用时往往受到严格的长宽比例的限制。临床上超过一定长宽比例的皮瓣远端常发生缺血坏死，目前尚无公认的最佳改善皮瓣存活的方法。皮瓣移植成功与两个因素有关：一是蒂部及血管网的血供营养，二是皮瓣基底及周边组织床新生微血管的及时长入。因此在蒂部血流一定的条件下，如何促进血管新生成为提高皮瓣存活面积一个关键因素。新生血管的及时形成对皮瓣的成活起着很重要的作用，如果阻断皮瓣与受床之间血运的建立，皮瓣的成活面积将减少。皮瓣远端缺血部分的成活过程与皮片相同，主要通过与受床间建立血运再血管化而成活。在目前众多的研究表明，血管内皮生长
24、因子(VEGF)是一种有效的促血管新生因子，它能刺激血管内皮细胞有丝分裂和增加血管内皮细胞渗透性促进血管生成，诱导NO 的生成1，进而起到促进组织愈合的作用。VEGF 有良好的生物学作用已经得到认可，很多学者也尝试了用各种不同的方法和途径通过外源性的 VEGF 作为补充来促进皮瓣的成活。组织在缺血后发生一系列的生物反应，组织的缺血引起 VEGF 浓度的升高，改变皮瓣的灌注，从而引起血管的舒张和新生血管的形成2，3。然而，由于皮瓣远端组织长时间严重的缺氧、缺血会使微血管及内皮细胞会受到直接损伤，使得内源性的 VEGF 来不及分泌，或在外源性的 VEGF 补充后远端组织的新生血管不能及时长入而导致
25、坏死。在缺血后 3h，我们就可以检测到 VEGF 受体 VEGFR-2 的表达，而在 18h 后就会发生衰减4。因此，我们在本实验中在使用 VEGF 的同时，联合引进了具有抗氧化，抗炎症，抗凋亡，可以提高机体抗缺氧能力的血红素氧化酶(HO-1)5。此酶能够延长随意皮瓣远端组织的抗缺氧时间，为 VEGF 促进新生血管的长入赢得了更加充足的时间，从而提高超长随意皮瓣远端组织的存活面积。 HO-1 是血红素代谢的起始限速酶，主要存在于细胞微粒体中。它能够将血红素分解为胆绿素、一氧化碳和铁6，7，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下进一步生成胆红素。胆红素和胆绿素能有效的清除氧自由基，有较强的抗氧化功能。在许
26、多因素作用下能诱导产生 HO-1 表达，是细胞在缺血再灌注8、低氧损伤、内毒素血症9、组织排异10等应激过程中的一种自我保护机制。Bussolati 等11提出 VEGF 诱导 HO-1 的表达，提高了 HO-1 在人内皮细胞中的活性。HO-1 抑制剂能够消除 VEGF 在体内非炎症的促血管新生反应。先前的体外实验证实了 HO-1 能诱导 VEGF 的分泌，HO-1 的大量表达会引起毛细血管样结构的增殖和形成12，13。Soares 等14研究发现，VEGF 和 HO-1 的表达会激发一个正反馈环的形成，即 VEGF 可以上调 HO-1 的表达，反之亦然。 基因表达载体有病毒表达载体和非病毒表
27、达载体。病毒表达载体有 RNA 逆转录病毒、DNA 腺病毒和 DNA 腺相关病毒( AAY)等；而非病毒表达载体有质粒、脂质体、裸 DNA 和基因枪等。目前被研究应用最多也最方便的是腺病毒载体。腺病毒载体的优点有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；不整合到染色体中，无插入致突变性；能同时表达多个基因等。正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。 在本实验中，我们将 VEGF 和 HO-1 有机的结合在一起，使其两者发挥更大的生物学效应。并以腺病毒为载体转染靶细胞，使其能持续表达目的蛋白，有
28、助于克服传统的生物制剂半衰期短，活性低，成本高等缺点。以腺病毒在载体联合应用 VEGF 和 HO-1 能否提高随意皮瓣远端组织的成活面积，目前国内外未见相关报道。为此，我们设计了本实验课题，进行了以下三个部分的实验研究。 1Ad5-VEGF 和 Ad5-HO-1 非增殖腺病毒的构建与制备 目的：构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)和血红素氧合酶(HO-1)的重组腺病毒载体(Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1)，为后续的基因转染、体内实验提供实验基础。 方法：引物合成后获取目的基因，将质粒 PDC315-VEGF 和 PSUCMV-HO-1 与含有5 型腺病毒右臂的质粒 pBHG
29、E3 通过 Lipofectamine2000 共转染至 293 细胞。共转染后 9-14 天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒 DNA 并应用PCR 进行鉴定。将重组出的病毒在 293 细胞中反复大量扩增，通过氯化铯密度梯度离心法进行纯化，并用 TCID50 法计算病毒滴度。 结果：经鉴定正确的腺病毒命名为 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1。测得重组腺病毒 Ad-VEGF 滴度为 110m pfu/ml，病毒 Ad-Ho-1 滴度为 7.5109 pfu/ml。结论：成功构建了复制缺陷型重组腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其滴度高，毒性低，可用于体外转染
30、。 2腺病毒 Ad-VEGF 和 Ad-HO 的体外实验研究 目的：探讨重组腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1 转染成纤维细胞 BJ 后目的蛋白的表达情况和对 BJ 细胞生长、增殖分化的影响。 方法：用报告基因 Ad-EGFP 转染靶细胞，观察其在荧光显微镜下的荧光强度和流式细胞仪来检测腺病毒的转染效率和强度。用ELISA 的方法检测 Ad-VEGF165 在 BJ 细胞中定量表达，用免疫组化和 WESTERN BLOT 检测 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达情况。MTT 检测腺病毒对 BJ 细胞增殖活性的影响。 结果：腺病毒介导的目的基因对 BJ 细胞有较高的转染效率
31、，随着 MOI 的增强效率增高，具有量效关系。ELISA 可以检测到 VEGF 的有效表达，同时免疫组化和 WESTERN BLDT 也检测到了 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达。转染一周后 MTT 检测 OD 值，转染组细胞与未转染组细胞的 OD 值无显著性差异。结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 能在 BJ 细胞中有效表达，并且不会对BJ 细胞的增殖活性产生影响。 3Ad-VEGF 和 Ad-HO 联合应用提高大鼠超长皮瓣存活率的体内实验研究 目的：探讨腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能否提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积。 方法：以 SD
32、大鼠背部两侧超长随意皮瓣为模型15。将动物随机分为 5 组：Ad-VEGF165+Ad-HO-1(A 组)、Ad-VEGF165(B 组)、Ad-HO-1(C 组)、Ad-GFP(D 组)、病毒保存液 Ad-buffer(E 组)。分别在掀起皮瓣深筋膜层分 10 小部分注射。术后一周采用颈椎脱臼法处死。观察各个皮瓣的大体情况，存活面积，常规病理切片 HE 染色，皮瓣组织的 VEGF 和 HO-1 免疫组化检测，CD31 免疫组化和皮瓣新生微血管密度(MVD)计数，进行统计学分析。 结果：大体解剖及病理切片显示：Ad-VEGF165+Ad-HO-1 联合应用组皮瓣的成活面积及血管化程度明显高于其
33、他四组，B 组稍高于 C、D、E 三组，C、D、E 三组之间无明显差异(P0.05)。 结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能够提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积，降低皮瓣覆盖创面的风险。 综上所述，我们构建了携带 VEGF165和 HO-1 目的基因的非增殖腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其对提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积的疗效明显强于传统治疗。该方案充分发挥了HO-1 的抗缺氧、抗凋亡、抗炎症的能力和 VEGF165 的协同作用，为提高皮瓣的长宽比和成活率提供了新的临床治疗策率和新的思路。随意皮瓣是修复创面、重建功能、改善外形常用的皮瓣。
34、但临床应用时往往受到严格的长宽比例的限制。临床上超过一定长宽比例的皮瓣远端常发生缺血坏死，目前尚无公认的最佳改善皮瓣存活的方法。皮瓣移植成功与两个因素有关：一是蒂部及血管网的血供营养，二是皮瓣基底及周边组织床新生微血管的及时长入。因此在蒂部血流一定的条件下，如何促进血管新生成为提高皮瓣存活面积一个关键因素。新生血管的及时形成对皮瓣的成活起着很重要的作用，如果阻断皮瓣与受床之间血运的建立，皮瓣的成活面积将减少。皮瓣远端缺血部分的成活过程与皮片相同，主要通过与受床间建立血运再血管化而成活。在目前众多的研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)是一种有效的促血管新生因子，它能刺激血管内皮细胞有丝分裂和增
35、加血管内皮细胞渗透性促进血管生成，诱导NO 的生成1，进而起到促进组织愈合的作用。VEGF 有良好的生物学作用已经得到认可，很多学者也尝试了用各种不同的方法和途径通过外源性的 VEGF 作为补充来促进皮瓣的成活。组织在缺血后发生一系列的生物反应，组织的缺血引起 VEGF 浓度的升高，改变皮瓣的灌注，从而引起血管的舒张和新生血管的形成2，3。然而，由于皮瓣远端组织长时间严重的缺氧、缺血会使微血管及内皮细胞会受到直接损伤，使得内源性的 VEGF 来不及分泌，或在外源性的 VEGF 补充后远端组织的新生血管不能及时长入而导致坏死。在缺血后 3h，我们就可以检测到 VEGF 受体 VEGFR-2 的表
36、达，而在 18h 后就会发生衰减4。因此，我们在本实验中在使用 VEGF 的同时，联合引进了具有抗氧化，抗炎症，抗凋亡，可以提高机体抗缺氧能力的血红素氧化酶(HO-1)5。此酶能够延长随意皮瓣远端组织的抗缺氧时间，为 VEGF 促进新生血管的长入赢得了更加充足的时间，从而提高超长随意皮瓣远端组织的存活面积。 HO-1 是血红素代谢的起始限速酶，主要存在于细胞微粒体中。它能够将血红素分解为胆绿素、一氧化碳和铁6，7，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下进一步生成胆红素。胆红素和胆绿素能有效的清除氧自由基，有较强的抗氧化功能。在许多因素作用下能诱导产生 HO-1 表达，是细胞在缺血再灌注8、低氧损伤、内毒
37、素血症9、组织排异10等应激过程中的一种自我保护机制。Bussolati 等11提出 VEGF 诱导 HO-1 的表达，提高了 HO-1 在人内皮细胞中的活性。HO-1 抑制剂能够消除 VEGF 在体内非炎症的促血管新生反应。先前的体外实验证实了 HO-1 能诱导 VEGF 的分泌，HO-1 的大量表达会引起毛细血管样结构的增殖和形成12，13。Soares 等14研究发现，VEGF 和 HO-1 的表达会激发一个正反馈环的形成，即 VEGF 可以上调 HO-1 的表达，反之亦然。 基因表达载体有病毒表达载体和非病毒表达载体。病毒表达载体有 RNA 逆转录病毒、DNA 腺病毒和 DNA 腺相关
38、病毒( AAY)等；而非病毒表达载体有质粒、脂质体、裸 DNA 和基因枪等。目前被研究应用最多也最方便的是腺病毒载体。腺病毒载体的优点有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；不整合到染色体中，无插入致突变性；能同时表达多个基因等。正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。 在本实验中，我们将 VEGF 和 HO-1 有机的结合在一起，使其两者发挥更大的生物学效应。并以腺病毒为载体转染靶细胞，使其能持续表达目的蛋白，有助于克服传统的生物制剂半衰期短，活性低，成本高等缺点。以腺病毒在载体联合应用
39、 VEGF 和 HO-1 能否提高随意皮瓣远端组织的成活面积，目前国内外未见相关报道。为此，我们设计了本实验课题，进行了以下三个部分的实验研究。 1Ad5-VEGF 和 Ad5-HO-1 非增殖腺病毒的构建与制备 目的：构建含人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)和血红素氧合酶(HO-1)的重组腺病毒载体(Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1)，为后续的基因转染、体内实验提供实验基础。 方法：引物合成后获取目的基因，将质粒 PDC315-VEGF 和 PSUCMV-HO-1 与含有5 型腺病毒右臂的质粒 pBHGE3 通过 Lipofectamine2000 共转染至 293 细胞。共转
40、染后 9-14 天出现病毒空斑，经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒 DNA 并应用PCR 进行鉴定。将重组出的病毒在 293 细胞中反复大量扩增，通过氯化铯密度梯度离心法进行纯化，并用 TCID50 法计算病毒滴度。 结果：经鉴定正确的腺病毒命名为 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1。测得重组腺病毒 Ad-VEGF 滴度为 110m pfu/ml，病毒 Ad-Ho-1 滴度为 7.5109 pfu/ml。结论：成功构建了复制缺陷型重组腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其滴度高，毒性低，可用于体外转染。 2腺病毒 Ad-VEGF 和 Ad-HO 的体外实验研究 目的：探讨重组
41、腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1 转染成纤维细胞 BJ 后目的蛋白的表达情况和对 BJ 细胞生长、增殖分化的影响。 方法：用报告基因 Ad-EGFP 转染靶细胞，观察其在荧光显微镜下的荧光强度和流式细胞仪来检测腺病毒的转染效率和强度。用ELISA 的方法检测 Ad-VEGF165 在 BJ 细胞中定量表达，用免疫组化和 WESTERN BLOT 检测 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达情况。MTT 检测腺病毒对 BJ 细胞增殖活性的影响。 结果：腺病毒介导的目的基因对 BJ 细胞有较高的转染效率，随着 MOI 的增强效率增高，具有量效关系。ELISA 可以检测到 VEG
42、F 的有效表达，同时免疫组化和 WESTERN BLDT 也检测到了 Ad-HO-1 在 BJ 细胞中的蛋白表达。转染一周后 MTT 检测 OD 值，转染组细胞与未转染组细胞的 OD 值无显著性差异。结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 能在 BJ 细胞中有效表达，并且不会对BJ 细胞的增殖活性产生影响。 3Ad-VEGF 和 Ad-HO 联合应用提高大鼠超长皮瓣存活率的体内实验研究 目的：探讨腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能否提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积。 方法：以 SD 大鼠背部两侧超长随意皮瓣为模型15。将动物随机分为 5 组：Ad-VEGF1
43、65+Ad-HO-1(A 组)、Ad-VEGF165(B 组)、Ad-HO-1(C 组)、Ad-GFP(D 组)、病毒保存液 Ad-buffer(E 组)。分别在掀起皮瓣深筋膜层分 10 小部分注射。术后一周采用颈椎脱臼法处死。观察各个皮瓣的大体情况，存活面积，常规病理切片 HE 染色，皮瓣组织的 VEGF 和 HO-1 免疫组化检测，CD31 免疫组化和皮瓣新生微血管密度(MVD)计数，进行统计学分析。 结果：大体解剖及病理切片显示：Ad-VEGF165+Ad-HO-1 联合应用组皮瓣的成活面积及血管化程度明显高于其他四组，B 组稍高于 C、D、E 三组，C、D、E 三组之间无明显差异(P0
44、.05)。 结论：腺病毒介导的 VEGF165 和 HO-1 联合应用能够提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积，降低皮瓣覆盖创面的风险。 综上所述，我们构建了携带 VEGF165和 HO-1 目的基因的非增殖腺病毒 Ad-VEGF165 和 Ad-HO-1，其对提高大鼠超长随意皮瓣远端组织的成活面积的疗效明显强于传统治疗。该方案充分发挥了HO-1 的抗缺氧、抗凋亡、抗炎症的能力和 VEGF165 的协同作用，为提高皮瓣的长宽比和成活率提供了新的临床治疗策率和新的思路。随意皮瓣是修复创面、重建功能、改善外形常用的皮瓣。但临床应用时往往受到严格的长宽比例的限制。临床上超过一定长宽比例的皮瓣远端常
45、发生缺血坏死，目前尚无公认的最佳改善皮瓣存活的方法。皮瓣移植成功与两个因素有关：一是蒂部及血管网的血供营养，二是皮瓣基底及周边组织床新生微血管的及时长入。因此在蒂部血流一定的条件下，如何促进血管新生成为提高皮瓣存活面积一个关键因素。新生血管的及时形成对皮瓣的成活起着很重要的作用，如果阻断皮瓣与受床之间血运的建立，皮瓣的成活面积将减少。皮瓣远端缺血部分的成活过程与皮片相同，主要通过与受床间建立血运再血管化而成活。在目前众多的研究表明，血管内皮生长因子(VEGF)是一种有效的促血管新生因子，它能刺激血管内皮细胞有丝分裂和增加血管内皮细胞渗透性促进血管生成，诱导NO 的生成1，进而起到促进组织愈合的
46、作用。VEGF 有良好的生物学作用已经得到认可，很多学者也尝试了用各种不同的方法和途径通过外源性的 VEGF 作为补充来促进皮瓣的成活。组织在缺血后发生一系列的生物反应，组织的缺血引起 VEGF 浓度的升高，改变皮瓣的灌注，从而引起血管的舒张和新生血管的形成2，3。然而，由于皮瓣远端组织长时间严重的缺氧、缺血会使微血管及内皮细胞会受到直接损伤，使得内源性的 VEGF 来不及分泌，或在外源性的 VEGF 补充后远端组织的新生血管不能及时长入而导致坏死。在缺血后 3h，我们就可以检测到 VEGF 受体 VEGFR-2 的表达，而在 18h 后就会发生衰减4。因此，我们在本实验中在使用 VEGF 的
47、同时，联合引进了具有抗氧化，抗炎症，抗凋亡，可以提高机体抗缺氧能力的血红素氧化酶(HO-1)5。此酶能够延长随意皮瓣远端组织的抗缺氧时间，为 VEGF 促进新生血管的长入赢得了更加充足的时间，从而提高超长随意皮瓣远端组织的存活面积。 HO-1 是血红素代谢的起始限速酶，主要存在于细胞微粒体中。它能够将血红素分解为胆绿素、一氧化碳和铁6，7，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下进一步生成胆红素。胆红素和胆绿素能有效的清除氧自由基，有较强的抗氧化功能。在许多因素作用下能诱导产生 HO-1 表达，是细胞在缺血再灌注8、低氧损伤、内毒素血症9、组织排异10等应激过程中的一种自我保护机制。Bussolati 等
48、11提出 VEGF 诱导 HO-1 的表达，提高了 HO-1 在人内皮细胞中的活性。HO-1 抑制剂能够消除 VEGF 在体内非炎症的促血管新生反应。先前的体外实验证实了 HO-1 能诱导 VEGF 的分泌，HO-1 的大量表达会引起毛细血管样结构的增殖和形成12，13。Soares 等14研究发现，VEGF 和 HO-1 的表达会激发一个正反馈环的形成，即 VEGF 可以上调 HO-1 的表达，反之亦然。 基因表达载体有病毒表达载体和非病毒表达载体。病毒表达载体有 RNA 逆转录病毒、DNA 腺病毒和 DNA 腺相关病毒( AAY)等；而非病毒表达载体有质粒、脂质体、裸 DNA 和基因枪等。
49、目前被研究应用最多也最方便的是腺病毒载体。腺病毒载体的优点有宿主范围广，对人致病性低；在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因；能有效进行增殖，滴度高；不整合到染色体中，无插入致突变性；能同时表达多个基因等。正是由于具有以上一些优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域。 在本实验中，我们将 VEGF 和 HO-1 有机的结合在一起，使其两者发挥更大的生物学效应。并以腺病毒为载体转染靶细胞，使其能持续表达目的蛋白，有助于克服传统的生物制剂半衰期短，活性低，成本高等缺点。以腺病毒在载体联合应用 VEGF 和 HO-1 能否提高随意皮瓣远端组织的成活面积，目前国内外未见相关报道。为此，我们设计了本实验课题，进行了以下三个部分的实验研究。 1Ad5-VEGF 和 Ad5-HO-1 非增
