1、二、简答题1、说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则,即属名+种名+株名的各一个首字母,再加上序号. 基本原则: 3-4 个字母组成,方式是:属名+种名+株名+序号; 首字母: 取属名的第一个字母,且斜体大写;第二字母: 取种名的第一个字母,斜体小写;第三字母: (1)取种名的第二个字母,斜体小写;(2)若种名有词头,且已命名过限制酶,则取词头后的第一字母代替.第四字母: 若有株名,株名则作为第四字母,是否大小写,根据原来的情况而定,但用正体. 顺序号: 若在同一菌株中分离了几种限制酶,则按先后顺序冠以 I, 等,用正体.2、什么是限制性内切核酸酶的星号活
2、性？受哪些因素影向？答：类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。 概括起来，诱发星活性的因素有如下几种： (1)高甘油含量(5, vv)； (2)限制性内切核酸酶用量过高(100UugDNA)； (3)低离子强度(25 mmolL)； (4)高 pH(8.0以上)；(5)含有有机溶剂，如 DMSO，乙醇等； (6)有非 Mg2+的二价阳离子存在
3、(如 Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。3、影响 DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些？答：（1）DNA 的纯度 （2）DNA 甲基化的程度 （3）酶切消化反应的温度 （4）DNA 的分子结构 （5）核酸内切限制酶的缓冲液4、什么是 Klenow酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow 酶是 1974年 Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解 DNA聚合酶 I，得到两个片段，其中大片段的分子量为 75kDa，它具有 5-3聚合酶和 3-5外切核酸酶的活性，小片段具有5-3外切核酸酶活性。由于大片段失去了 DNA聚合酶 I中会降解 5引物的 5-3外切核酸酶的活性，所以在基因
4、工程中更有用。Klenow酶主要有下列用途：(1)修复反应，制备平末端可用 Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的 5或 3突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的 DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备 3末端标记的探针。用 Klenow酶修复 5突出末端的反应主要是利用了 Klenow酶的 DNA聚合酶活性，是填补反应；而修复 3突出末端则是用 Klenow酶的 3-5外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复 3突出末端是不理想的，改用 T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择
5、。(2) 标记 DNA3突出末端(protruding end)该反应分两步进行：先用 3-5的外切核酸酶活性除去 3突出末端，产生 3隐含末端，然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3-5)作用与聚合(5-3)作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchangereplacement reaction)。不过这一反应用 T4DNA聚合酶的效果更好，因它的 3-5外切核酸酶活性较强。(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行 DNA序列分析、用于 cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链 DN
6、A探针等。二、简答题1、什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌半乳糖苷酶的基因片段，携带有 lac基因片段的载体转入 lac的宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插人 lac(或 lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解 X-gal的能力，转入 lac-宿主菌后，在含有 5溴4氯3引哚D半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。2、什么是基因文库？用重组 DNA技术将某种生物细胞的总 DNA 或染色体 DNA的所有片断随机地连接
7、到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部基因都包含在内的情况下，这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。3、黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。答：黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段 DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不
8、止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。4、什么是同聚物加尾连接法？用何种方法加尾？具有哪些优缺点？答：所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链 DNA的 3端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源 DNA和载体 DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如 dA(dG)和 dT(dC),然后在 DNA连接酶的作用下涟接成为重组的 DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链 DNA分子的突出或隐蔽的 3-OH上。以 Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的 3-OH端逐个添加单核苷酸，如果用 Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的 3-OH端逐个添
9、加单个核苷酸。同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：(1)首先不易自身环化，这是因为同一种 DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的 DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。5、何谓接头连接法？答：将人工合成的或来源于现有质粒的一小段 DNA分子(在这一小段 DNA分
10、子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列)，加到载体或外源 DNA的分子上，这样便在载体 DNA和外源 DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的 DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。2、简答题 1、常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？ 答：限制性内切核酸酶,DNA 聚合酶和 Klenow大片段,DNA 连接酶,碱性磷酸酶,末端脱氧核苷酸转移酶. 限制性内切核酸酶, 能够识别特异的 DNA碱基序列， DNA碱基序列往往呈回文对称结构； DNA 聚合酶 a 位于细胞核内，也许是复合物，有催化细胞增生的作用； Klenow大片段它也可以通过基因工程得到，分子量为 76kDa 。
11、DNA连接酶负责双链 DNA中相邻 3-OH与 5-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形成。 碱性磷酸酯酶的作用是从 DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去 5磷酸根残基。 末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到 DNA分子的 3-OH末端。 2、重组 DNA技术常包括哪些基本步骤？答：获得目的基因； 与克隆载体连接，形成新的重组 DNA分子； 用重组 DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； 对转化子筛选和鉴定。在具体工作中选择哪条技术路线； 对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。主要取决于基因的来源、基因本身的性质和该项遗传工程的目的。
12、 2、何为载体？一个理想的载体应具备那些特点？答：将外源 DNA或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为载体 载体具备的特点：在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点） 必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制 有一定的选择标记，用于筛选 最好具有较高的拷贝数，便于制备。4、抗性基因是目前使用的最广泛的选择标记，常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？答：氨苄青霉素抗性基因 ampr 、 四环素抗性基因 tetr、氯霉素抗性基因 Cmr 、 卡那霉素和新霉素抗性基因 kanr 氨苄青霉素抗性基因 ampr: 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结
13、合并抑制其活性，抑制转肽反应. 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶，该酶可分泌进入细菌的周质区，抑制转肽反应并催化 b-内酰胺环水解（水解青霉素） ，从而解除了氨苄青霉素的毒性。 四环素抗性基因 tetr： 四环素可与核糖体 30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。四环素抗性基因编码一个由 399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。三、论述题1、什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组 DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体 DNA
14、或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC 文库、BAC 文库等。三、论述题 1、何谓限制性核酸内切酶？写出大多数限制性核酸内切酶识 DNA 序列的结构特点。 答：限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA分子中特异性核苷酸序列并由此特
15、异切割DNA双链结构的水解酶. 是在 DNA分子内部切割，水解磷酸二酯键的核酸内切酶。能够识别特异的 DNA碱基序列， DNA 碱基序列往往呈回文对称结构；并具有特异切割位点。17.如何以细菌（或者大肠杆菌 E.coli）质粒 DNA为载体克隆一个编码大鼠生长激素的基因，并转化到细菌（或者大肠杆菌 E.coli）中进行表达。分析一下在实验中可能遇到哪些问题及可能的解决办法？答：（一）要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到的问题有：(1)细菌的 RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。 （解决办法：在 cDNA前加上细菌的启动子。 ）(2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前
16、体 mRNA中被切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。 （以激素基因的 mRNA为模板反转录成cDNA。 ）(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分工加工而来的，例如胰岛素就是通过加工去除前体分子内部的 33个氨基酸残基而来，剩下的两段肽链分别形成胰岛素的 a、b 链。 （有时可以在离题的条件下进行蛋白质加工过程。 ）(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降解。 （选用合适的突变型宿主。 ）（二）针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子 ATG的细菌强启动子的附近可以以激素的 mRNA为
17、模板用反转录酶合成激素的基因。这种 DNA不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码 ATG、通过该激素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及 12个终止密码：ATG编码序列TGATAG。现在，这个合成基因可被插入载体中。有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合成基因，从而免除加工过程。选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。26、建立了一个文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆？答：带有某一细菌基因的
18、克隆通常可以直接看出来，因为基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化。然而，真核生物的基因不都表达，则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常用方法是噬菌斑杂交（原位杂交） 。(1)从不同的克隆提取 DNA，固定于硝酸纤维素滤膜上，然后用 NaOH使之变性；(2)烤干；(3)用带放射性同位素标记的探针与特定基因进行碱基配对(杂交)，冲洗滤膜后，未结合上的标记探针会被除去；(4)烘干滤膜后进行放射自显影后，所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来，对照原来的平板，便可以挑选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。转基因技术所带来的好处是
19、显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种；第二，延长食品保存时间或增加营养成分；第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力， 减少了农药的使用量，有利于环境保护；第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物， 产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。转基因作物的大面积种植已有数年， 食用转基因食品的人群至少有 10 亿之多，但至今仍未有转基
20、因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可， 食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。三、论述题 1、分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？答：同：原理相同。琼脂糖、聚丙烯酰胺均为无反应活性的稳定支持介质，可降低对流运动，故使电场中的分子电泳迁移率仅与分子的摩擦系数成反比。在一定电场强度下，DNA分子的迁移率取决于核酸分子的大小和构象。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙大小；浓度越高，空隙越小，其分辨能力也就越强；反之，浓度降低，空隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。
21、 异：琼脂糖凝胶分辨 DNA片段的范围为 02.Kb-50Kb之间；而聚丙烯酰胺分辨 DNA片段的范围为 1-1000bp，分离小片段效果最好，分辨率极高，相差 1bp的 DNA也可分开。33. 质粒的类型1)F 质粒:又叫 F 因子或性质粒(sex plasmid)。它们能够使寄主染色体上的基因和 F 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。F 质粒，又称 F 因子，即致育因子,在寄主细胞中以三中不同的形式存在：以染色体外环形双链质粒 DNA 形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或 DNA 片段，这样的细胞称为 F+细胞;.以染色体外环形双链质粒DNA 形式存在，同时在其上携带
22、有细菌的染色体基因或 DNA 片段，这样的细胞称为 F细胞:以线性 DNA 形式从不同位点整合到寄主染色体上，这样的细胞称为 Hfr 细胞（高频重组细胞）2).R 质粒:通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力3) .Col 质粒 :即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有 Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。34. 分类：. 结合型质粒（conjugative plasmid） ，又叫自我转移质粒，除了具有自主复制所必需的遗传信息之
23、外，还带有一套控制细菌配对和质粒结合转移的基因. 非结合型质粒（non-conjugative plasmid） ，又称非自我转移的质粒，具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此，不能从一个细胞自我转移到另一个细胞70. 碱裂解法原理：染色体 DNA 比质粒 DNA 分子大得多，且染色体 DNA 为线状分子，而质粒 DNA 为共价闭合环状分子；当用碱处理 DNA 溶液时，线状染色体 DNA 容易发生变性，共价闭环的质粒 DNA 在回到中性 pH 时即恢复其天然构象；变性染色体 DNA 片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒 DNA分子则以溶解状态存
24、在液相中，从而可通过离心将两者分开。1 如何有效地提高外源基因的表达效率？提高启动子强度 缩短启动子同克隆基因间距离 高效的翻译起始序列 高效的转录终止区 提高质粒拷贝数及稳定性 用以下方法提高翻译水平：调整 SD序列与 AUG间的距离用点突变的方法改变某些碱基增加 mRNA的稳定性的 减轻细胞的代谢负荷：诱导表达表达载体的诱导复制 提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：克隆一段原核序列，表达融合蛋白采用某种突变菌株表达分泌蛋白质1、PCR 的原理和主要反应过程，并分析影响 PCR 扩增的影响因素。PCR 原理：变性温度下， DNA 双链变性双螺旋解开成单链 DNA，在退火温度中人工合成的特异引物
25、根据碱基互补配对原则与单链 DNA 特异结合，然后在 DNA 聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板 DNA互补的新链，实现 DNA 的扩增。影响 PCR 扩增的影响因素：(1)Taq 酶：常用 1U/25L浓度低，扩增产物不够；浓度高，非特异性扩增增加；酶的活性；(2)dNTP 的浓度：常用 100-200mol/L，不能低于 20mol/L，特异性、保真性；(3)模板：主要考虑纯度及使用量，对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个 ng 到 100ng.(4)引物浓度：0.1-0.5mol/L 之间，过多则非特异扩增增加
26、，形成引物二聚体；(5)Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L；影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性(6)PCR 反应程序设定：变性温度和时间、引物退火温度 Tm 与时间、引物延伸温度与时间和循环数2、PCR 引物设计的原则，若给一指定 DNA 序列并需要通过 PCR 扩增此序列，如何设计扩增引物？（关于如何设计这个问题，靠自己了）引物设计原则：1、G+C 含量 45-55%；2、Tm 值高于 55；3、引物特异性；4、引物扩增跨度；5、是否形成引物二聚体3、Southern 杂交一般过程及影响杂交因素。Southern 杂交操作步骤:(1) 用限制性内切酶酶切 DNA, 经凝胶电泳
27、分离各酶切片段； (2) 转膜：将 DNA 片段转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；(3) 预杂交：封阻滤膜上非特异性位点； (4) 杂交：让探针与同源 DNA 片段特异性结合；(5) 洗脱：去除非特异性结合的探针；(6) 自显影检查目的 DNA 所在的位置。Southern 杂交影响因子1） 、目的 DNA 在总 DNA 中所占的比例2） 、探针的大小和标记效率3） 、转移到滤膜上的 DNA 量4） 、探针与靶 DNA 的同源性4、基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？基因组文库的构建过程：1）从生物体提取大片断的基因组 DNA；2）用适当的限制性内切酶（常为 4 碱基识别位点）进行部分酶切
28、或超声波打断基因组DNA ；3）在琼脂凝胶电泳上或蔗糖梯度离心筛选适当长度的 DNA 片断（根据载体的要求） ； 4）载体的酶切、回收；5）将处理好的基因组 DNA 片断与载体连接；6）将重组子导入宿主细胞7）文库的鉴定、收集、保存；确定文库大小的方法：以在构建的基因组文库中任一基因存在的概率来衡量文库的质量或完备性，它与基因文库最低所含克隆数 N（即文库大小）之间的关系可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中：N：文库所需的总克隆数；P：任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率；f：克隆片段的平均大小/ 生物基因组的大小。1、 什么是星活性，产生星活性的因素
29、可能有哪些？在非最适合的条件下酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种活性称星活性。产生 Star 活性的因素：（书上 P46-P47 答案）高浓度甘油，碱性 pH，存在 Mn2+，低离子强度，低盐浓度，低 pH2、 限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。 （例子和图帮助大家理解而已）命名规则：寄主菌属名的第 1 个字母种名的前两个字母菌株或菌型代号（大写）空白发现序列（罗马数字）例子：EcoR(E：属名；co ：种名； R：株；：发现次序 )3、 简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。同裂酶：识别序列相同，
30、切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。 不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。 ）4、 基因工程中常用的 DNA 聚合酶主要有哪些？1）大肠杆菌 DNA 聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA 聚合酶 4）T4 DNA 聚合酶 5）修饰过的 T7 DNA 聚合酶 6）逆转录酶7）Taq DNA 聚合酶1、 作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） ； 具有合适的筛选标记； 具有较高的外源 DNA 的载装能力； 具有多克隆位点（MCS） ； 具有与特定受体细胞相适应的复制
31、位点或整合位点。星活性（star ctivity）在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。所谓非最适的反应条件：过量酶、低盐浓度、过量甘油、高pH（8.0 以上） 、有机溶剂 ex：酒精（EcoR I 对酒精敏感） 、SDS、苯酚、氯仿等。Southern 杂交原理和步骤原理：将待检测的 DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA或 RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理
32、进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。步骤：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的 DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:(1) 酶切 DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使 DNA原位变性。(2) 将 DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。(4) 让探针与同源 DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。(5) 通过显影检查目的 DNA所在的位置。探针标记的方法：1、缺口平移法 （Nick Translation）原理及过程：反应体系中 DN
33、A酶 I随机在探针 DNA上打开缺口，然后利用 DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按 5 3方向切除单核苷酸；同时 DNA聚合酶I有 5 3的聚合酶活性，在缺口处 3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA 聚合酶 I的两种作用交替进行，探针即被标记。2、随机引物法（6 核苷酸引物标记法）原理及过程：利用 E.coli DNA聚合酶 I的 Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow 具有 5 3聚合酶活性。被标记的 DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在 Klenow的催化下，以引物 3端为起点，沿
34、模板 3 5方向合成 DNA新链。反应体系中含有标记的 dNTP,随机掺入新合成的 DNA链中，探针即被标记。3、末端标记多核苷酸激酶的用途:DNA5-OH 端磷酸化、标记 DNA的 5端（1）正向反应 （2）交换反应标记法61. PCR 技术的基本原理; 无细胞分子克隆法：在微量离心管中 ,加入适量的缓冲液, 微量的模板 DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成 DNA 的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过 30 次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的 DNA 带。 63. 引物设计：（1
35、)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以 15-40 bp 为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C 占 50-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物 3端为关键碱基； 5端无严格限制。79.核酸分子杂交技术概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。影响杂交的因素：核酸分子的浓度和长度（浓度大，复性快；分子量大，复性慢） 。温度。离子强度。杂交液中的甲酰胺。核酸分子的复杂性。非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子 DNA90. 作为选择标记基因，必需具备条件：。1）编码一种不存在
36、与正常植物细胞中的酶 2）基因较小，可构成嵌合基因 3）能在转化体中充分表达 4）检测容易，且能定量分析1、理想质粒载体的必备条件？答： 具有较小的分子质量和较高的拷贝数。具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。具有两种以上的选择标记基因。缺失 mob 基因。插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并自制和表达。1、什么是包涵体？重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。2、什么是 -互补筛选？质粒载体具有 -半乳糖苷
37、酶基因（ lacZ） ，当外源 DNA插入到它的 lacZ，可造成表达后的 -半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌落在添加有 X-gal-IPTG培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大肠杆菌上带有 lacZ基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种 lacZ基因上缺失了一部分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫 互补。4 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较
38、了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。缺点：在通常情况下，细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。基因克隆、基因操作、基因重组、基因工程的概念及其相互联系。答：基因克隆（Genecloning）：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，
39、其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。基因工程：是通过基因操作，将目的基因或 DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。基因重组：不同来源 DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的 DNA分子的过程。它们的相互关系：基因工程是通过基因重组实现的，但基因重组并不都是严格意义上的基因工程，基因重组是基因操作范畴的概念，包括实验研究和生物技术的基因重组事件，而基因工
40、程则专指为实践应用而进行的重组事件。基因操作是基因工程的技术基础；基因克隆很多时候并不涉及遗传的改良。3、简述基因工程的基本过程和四个基本条件？答：1、目的基因克隆；2、载体的准备；3、目的基因和载体的连接；4、重组 DNA转化/转染/转导；5、重组体的筛选与鉴定；6、重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发利用。四个基本条件：1、目的基因；2、载体；3、工具酶；4、受体细胞。12、如何使用 Methylase（甲基化酶） 对克隆 DNA 进行保护？此步骤有什么意义？答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆 DNA 先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别
41、序列先行保护起来。然后再插入片段末端加上接头，并经适量 RE切割产生粘端分子，再提纯这些分子与去磷酸化的载体连接。意义：用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。75、何为载体?一个理想的载体应具备那些特点？将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体载体具备的特点：在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制;有一定的选择标记，用于筛选；最好具有较高的拷贝数，便于制备。23、印
42、迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。答：Southern 杂交是以 DNA或 RNA为探针，检测 DNA链，用于外源基因整合的鉴定及分析。Northern杂交是以 DNA或 RNA为探针，检测 RNA链，用于外源基因转录产物特异 mRNA的检测。Western 杂交是利用抗原与抗体的特异结合的原理检测外源基因表达产物特异蛋白质的生成。61什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组 DNA的各种片段的克隆群。一般以改造的噬菌体 DNA或黏
43、粒作为载体。构建基因文库的基本步骤：总 DNA的提取；载体的制备、纯化；基因组 DNA的不完全消化；载体与外源 DNA片段的连接；转化受体菌，然后在有选择压力的平板上培养转化了外源基因的受体菌；重组子的鉴定；外源 DNA 进行分析。基因组文库同遗传学上所讲的基因库的不同：基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC 文库、BAC 文库等。64、与基因文库相比，cDNA 克隆的主要优点与缺点有哪些？答：主要优
44、点:cDNA 克隆以mRNA 为材料，特别适用于某些RNA 病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA 基因文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA 克隆都含有一种mRNA 序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。cDNA 克隆可用于在细菌中能进行表达的基因克隆，直接应用于基因工程操作。cDNA 克隆还可用于真核细胞mRNA 的结构和功能研究。主要缺点：cDNA 文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA 文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA 基因文库不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列的结构与功能方
45、面的信息。在cDNA 基因文库中，对于低丰度mRNA 的cDNA 克隆所占的比例则比较低，且分离也就比较困难。65、什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?答“同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA,即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA重组导人寄主细胞，经筛选得到韵cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种
46、通用方法。由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某生物全部编码基因。cDNA文库与基因组文库的主要差别是：(1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响；(3)基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而eDNA克隆的是不含内含子的基因。63.PCR 引物
47、设计时需要注意哪些基本原则？答：引物长度以2030bp 为宜，过长过短都会降低特异性，而且过长会增加成本。引物碱基要随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象，G+C 含量为4555%左右。引物内部不应含有回文结构，两个引物之间尤其是3端不应有互补链存在。引物的碱基顺序不应与非扩增区有同源性。引物3末端碱基原则上要求与模板DNA 配对。引物5末端允许有几个碱基不与模板DNA 匹配而呈游离状态，这不影响扩增的特异性。引物的5端一般加有适当限制性核酸内67、简述PCR 技术的基本原理答：变性：通过加热使DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。退火： 当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂
48、得多，而且反应体系中引物DNA 量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA 双链之间到互补的机会较少。延伸：在DNA 聚合酶和4 种脱氧核糖核苷酸底物及Mg 2+存在条件下，53的聚合酶催化以引物为起点的DNA 链延伸反应。以上3 步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板， 数小时后, 介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达210 6-7 拷贝。51、PCR 产物的克隆与一般的 DNA片段的克隆有何异同点?（PCR 是模拟体内 DNA复制的一种扩增基因的技术，两者之间有着较多相似的地方。试列举两者之间的相同点有哪些？）答：相同点：
49、原理相同，都是利用碱基互补配对原则；都是半保留复制；都需要引物；都是利用 4种 dNTP合成新的 DNA；都需要多种酶的参与。不同点：前者在体外进行，后者在体内进行；聚合酶链式反应（PCR）不会产生冈崎片段；DNA 片段的克隆只有在细胞有丝、减数分裂的时候进行 DNA复制，而 PCR可反复进行。细胞中的 DNA复制受到许多复杂的因子的调控两者进行的程度不同。也可列表对比：49、什么是蓝白斑筛选？其原理是什么？答：概念：根据 -半乳糖苷酶显色反应筛选含有外源 DNA插入序列的重组体克隆。原理：当外源 DNA插入到载体 lacZ标记基因上，导致 -半乳糖苷酶基因失活，因此通过大肠杆菌转化子菌落在添加有 X-gal-IPTG培养基中的颜色由蓝色变成白色菌落这一颜色变化直接观察出来。2、影响外源基因表达的因素有哪些？它们是如何影响外
