1、基因工程原理与应用期末复习资料提供者：友哥第一章 绪论1、基因工程的核心内容是基因体外重组(DNA 体外重组) 。2、基因工程的四大要素(或基本条件 )：目的基因、载体、工具酶、受体。3、基因工程诞生技术基础：限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割； DNA 连接酶的发现与 DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用。 4、1973 年，斯坦福大学的 S.Cohen 研究小组的 DNA 体外重组和大肠杆菌转化实验。这一实验的成功标志着基因工程的诞生，因此，1973 年被定为基因工程诞生的元年。 5、1982 年首次通过显微注射培育出世界上第一个转基因动物转基因小鼠。 1983 年采用农杆菌介
2、导法培育出世界上第一例转基因植物转基因烟草。 6、基因工程的基本操作程序（基本操作内容）：分离获得带有目的基因的 DNA 片段及载体选择与构建。限制性核酸内切酶分别切割外源 DNA 和载体。通过 DNA 连接酶将外源基因 DNA 片段连接到载体上，形成重组 DNA 分子。将重组 DNA 分子引入到受体细胞( 转化)。带有重组体细胞(转化体) 的扩增及选择培养。转化体的鉴定，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。目的基因的进一步研究分析，并设法使之实现功能蛋白的表达(基因功能研究或基因改造研究) 。 7、转化与转化体的定义第二章 基因工程的工具酶1、工具酶是指基因工程操作中所使用的核酸酶类
3、。根据其用途分为四类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、修饰酶。2、限制作用(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体 DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。这是维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰作用(modification) ：指寄主本身的 DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。这是宿主细胞识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用机制。3、限制性核酸内切酶的命名：限制性核酸内切酶第一个字母(大写，斜体) 代表该酶的宿主菌属名(genus)第一个字母；第二、三个字母(小写，斜体 )代表宿主菌种名(spe
4、cies)前两个字母。第四个字母代表宿主菌的菌株名的第一个字母(小写，正体 )或染色体外成分(质粒或噬菌体，大写，正体)。若从一种菌株中发现了几种限制性核酸内切酶，即根据发现和分离的先后顺序用罗马字母表示(正体) 。Haemophilus influenzae d 流感嗜血杆菌 d 株 Hind Hind 4、II 型限制性内切酶的识别序列：一般为 46bp 的回文序列。也有 6bp 以上的，如 NotI，称为稀有切割限制酶。有些为反向重复序列(间断回文序列) ，如 SfiI。有些 II 型限制酶的识别序列中，某一位或二位碱基并非严格专一，如 Hind II 可识别 4 种核苷酸序列。 酶 识
5、别序列 酶 识别序列BamH I GGATCC Pst I CTGCA GBgl II A GATCT Sal I G TCGACEcoR I G AATTC Sau3A I GATCHind II GTPy PuAC Sfi I GGCCNNNN NGGCCHind III A AGCTT Sma I CCC GGGKpn I GGTAC C Xba I T CTAGANot I GC GGCCGC Xho I C TCGAG5、II 型限制性核酸内切酶的切割方式：大多数 II 型限制性核酸内切酶均在其识别位点内部切割双链DNA，水解磷酸二酯键中 3位的酯键，产生 3端为羟基、5 端为磷酸基
6、团的片段。有三种切割方式：在识别序列的对称轴的 5末端切割，产生 5黏性末端，如 EcoRI。在识别序列的对称轴的 3端切割，则产生 3黏性末端， 如 PstI。在识别序列的对称轴上切割，产生平头末端，如 PvuII。有些识别序列为间断型回文序列的 II 限制酶，其切点位于不确定核苷酸中，如：Bgl I ： GCCNNNNNGGC Sfi I ：GGCCN NNNNNGGCC Xmn I ：GAANNNNTTC 有极少数 II 型限制性核酸内切酶的切割位点远离识别序列，如 Mbo II 识别 GAAGA 序列，切割位点则是：5 GAAGANNNNNNNN N 33 CT TC TNNNNNNN
7、N N56、同裂酶是指识别序列相同、切割方式相同或不同、来源不同的 II 限制性核酸内切酶。同尾酶是指来源各异、识别序列不同，但产生相同的黏性末端的 II 限制性核酸内切酶。7、II 型限制性核酸内切酶的酶切反应（1）标准酶解体系的建立：反应体积一般为 20l(根据 DNA 量可适当扩大) 。 10酶切缓冲液 2l( 大部分酶反应缓冲液基本相似：50mmol/LTris-HCl pH7.07.5、0100mmol/L NaCl、 10mmol/L MgCl2、 1mmol/L DTT)；酶( 根据酶活力大小及工作性质确定酶量，不超过反应总体积 10 ；DNA 样品( gmg)；无菌水。 限制性
8、核酸内切酶的一个活力单位(U)为：在合适的温度和缓冲液中，在 20 L 反应体系中，1h 完全降解 1ug 标准 DNA 所需要的酶量。 （2）限制性核酸内切酶对 DNA 的不完全酶解（应用在哪些方面）：不完全酶解对于构建物理图谱和基因组文库是非常必要的。其方法有减少酶量、增加反应体积、缩短反应时间和降低反应温度等。 8、星号活性是指在极端非标准反应条件下，限制性核酸内切酶能切割与特异识别序列相似的序列的特性。引起星号活性的原因有：高甘油含量，大于 5%；酶用量过大，大于 100U/微克 DNA；低离子强度，小于 25mmol/L； 高 pH，大于 8.0；含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基
9、乙酰胺等；Mn2+、Cu2+ 、Co2+、Zn2+等非 Mg2+的二价阳离子的存在。常发生星活性的内切酶有：EcoRI、Hind、KpnI、PstI、SalI、HinfI 等。 9、DNA 连接酶是指能催化双链 DNA 分子内或分子间的 5-磷酸基和 3-羟基生成磷酸二酯键而使 DNA 链连接的一类酶。DNA 连接酶的种类：（1）T4 噬菌体 DNA 连接酶(T4 DNA 连接酶)（重点） 平头末端的 Km 比黏性末端的 Km 高约 1000 倍。提高平头末端连接效率的方法：加大酶浓度(10100 倍于粘性末端)； 加大底物浓度； 加入适量的一价阳离子 (150-200 mmol/L NaCl
10、)； 加入低浓度的 PEG(10%PEG8000)。ATP 的最适终浓度为 0.5 mmol/L。 （2）大肠杆菌 DNA 连接酶（3）T4 噬菌体 RNA 连接酶 10、DNA 连接酶的反应体系：10L 或 20L，DNA 片段，连接酶，Buffer，温度(1216或30)，时间(416h)Buffer：50mmol/LTris-HCl pH7.6，10mmol/L MgCl2， 0.5mmol/L ATP，5mmol/L DTT11、影响连接反应的因素：DNA 末端的浓度 连接产物的分子构型( 线形或环状)与 DNA 浓度及 DNA 分子长度存在密切关系。在一定浓度下，小分子 DNA 片段
11、进行分子内连接，有利于形成环化分子。对于长度一定的 DNA 分子，其浓度增加有利于分子间连接。此外，分子间连接还与两种片段的末端浓度的比例有关。原则上一种片段的浓度大于另一一种片段的浓，如：在克隆中，插入片段:载体片段=2:1。12、切口平移作用（P26） 主要用途：切口平移法制备 DNA 探针13、对天然的 T7DNA 聚合酶进行修饰，使之降低或完全失去 35的外切酶活性，而聚合酶活性增加了3 倍。因此，修饰的 T7 DNA 聚合酶主要用于双脱氧测序，又称作为测序酶。14、Taq DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶具有 53聚合酶活性和 53 外切酶活性，缺少 35 外切酶活性。其最大特
12、点是热稳定(95以上高温半小时不失活) ，最适反应温度高 (70 75)。因此，其主要用途是 PCR 及 DNA 测序( 具有二级结构的 DNA)。保真的 PCR 酶有 Tma DNA 聚合酶(Thermotoa maritima 海栖热袍菌)、Tli DNA 聚合酶(Thermococcus litoralis 海栖热球菌)、Pfu DNA 聚合酶(Pyrococcus furiosus 激烈火球菌)、 Pwo DNA 聚合酶(Pyrococcus woesi 沃氏火球菌) 。 15、商品化的逆转录酶主要是鸟类骨髓母细胞瘤病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆
13、转录酶和Moloney 鼠白血病病毒 (Moloney murine leukemia virus，Mo-MLV) 逆转录酶。其用途有：合成 cDNA 第一链，构建 cDNA 文库；RT-PCR；以 RNA 为模板制备 DNA 探针；补平和标记 5-末端突出的 DNA 片段；代替 Klenow 酶用于 DNA 序列分析。16、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶 ) 用途：给载体和外源 DNA (如 cDNA 或随机切割 DNA)接上同聚物尾，以便连接；末端标记17、核糖核酸酶 H（作用底物） RNase H 特异地降解 DNA/RNA 杂交双链中的 RNA 链，产生具有 3-OH 和 5-磷酸末
14、端的寡核苷酸和单核苷酸，不能降解单链或双链的 DNA 或 RNA。其用途是产生 cDNA第二链合成的引物。18、S1 核酸酶的作用底物（P32）19、碱性磷酸酶的用途5末端标记前的处理 ；去除载体片段的 5磷酸基因，防止载体自身连接。 第三章 基因工程载体1、载体(vector)是指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”，其本质是 DNA 复制子。必备基本条件：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自主复制；具有合适的限制性内切酶位点； 具有合适的选择标记基因。2、质粒载体的 3 个共同组分（P41）3、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，13 拷贝 ；松弛型：不严格受宿主控制， 102
15、00 拷贝 （P42 ） 4、理想质粒载体的必备条件：具有较小的分子量和较高的拷贝数 ；具有若干限制性酶的单一酶切位点(多克隆位点，multiple cloning sites，MCS)；具有两种以上的选择标记基因； 缺失 mob 基因或nic 位点； 插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。 5、多克隆位点(多接头，polylinker，或限制性酶切位点库）是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的 DNA 片段。6、载体构建的基本原则：根据基因操作的工作需要；符合理想载体的必备条件；选择适合的亲本质粒提供载体元件；尽量简化构建程序7、pBR322 的构建
16、的 3 个亲本质粒（P45）8、pUC 系列载体（P48） 、T 载体9、分泌型表达载体与非分泌型表达载体的差异（P50）10、穿梭质粒载体是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。11、插入型载体：只具有一个克隆位点可供外源 DNA 插入的 噬菌体载体。克隆容量较小，一般在10kb 以内，用于 cDNA 及小片段 DNA 的克隆。 取代型载体：具有成对的克隆位点以使两个位点之间的 DNA 区段可以被外源 DNA 片段取代的 噬菌体载体。克隆容量较大，20kb 左右，常用来构建高等真核生物的基因组文库。 12、野生型 噬菌体不能在在 P2
17、 噬菌体的溶源菌中生长，即为 Spi+表型。当其缺失 red、gam 基因，就能在 P2 溶源菌中能生长并形成噬菌斑，便获得 Spi-表型。这类载体的中间填充片段上都具有 red、gam 基因，当中间填充片段被外源 DNA 取代后，重组体便能在 P2 溶源菌中生长并形成噬菌斑，而非重组体则不能在 P2 溶源菌中生长，这种筛选重组体的方法称为 Spi-选择。13、M13 噬菌体载体的主要用途：DNA 测序；基因定点突变； 探针制备。14、噬菌粒载体是一类含有单链噬菌体(M13)复制起点的质粒载体。15、黏粒载体是一类含有 噬菌体 cos 序列的质粒载体。又称柯斯质粒载体。黏粒载体的最大克隆容量为
18、 48kb(如 pHS262)，最低为 14kb(如 pJC720)。 16、黏粒克隆存在的问题及解决方案在连接反应中，黏粒载体片段彼此首尾相连形成多聚体分子。解决方案：一是用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；二是使用 Ish-Horowicz-Burke 黏粒克隆方案(见下图) ；三是使用 Bates-Swift 黏粒克隆方案(双 cos 序列的黏粒载体，见下图)。在连接反应中，酶切的基因组 DNA 片段( 特别是较小的 DNA 片段) 往往会出现两个或数个片段随机再连接，串联地插入到载体上，其连接顺序并不符合基因组中排列顺序。因此，DNA 序列分析结果往往会出现错误。解决方案是将局部
19、消化产物通过凝胶电泳分级分离，获得长度为 3145kbDNA 片段。 17、酵母人工染色体(YAC) 酵母自主复制序列；酵母着丝粒；四膜虫端粒；酵母选择性标记(Trp1、Ura3、Sup4抑制宿主细胞 ade2 的琥珀突变) 。克隆容量： 1002000kb 细菌人工染色体 (BAC) 来源于 F 质粒。克隆容量：300kb；优点：拷贝数低，稳定，比 YAC 易分离。 18、表达载体构建的一般原则：（1）阅读框架与外源基因高效表达 表达载体一般都有三种变体，以适用于具不同阅读框架酶切位点的基因表达。用人工接头可以调节阅读框架。（2）启动子与外源基因高效表达 转录起始的速率是基因表达的主要的限速
20、步骤。选择强启动子增强子是构建高效表达载体的首要问题。（3）转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达 除去衰减子；插入抗转录终止序列； 强转录终止序列；原核生物一般用 rrnB。真核生物 poly(A) 位点。（4）有效的翻译起始与外源基因高效表达（5）终止密码与外源基因高效表达 原核生物表达载体：UAA，或几个终止密码串联。（6）密码子选择与外源基因高效表达 消除基因中的限制密码，以其他同义密码替代。（7）外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达构建融合表达载体，表达融合蛋白；构建分泌表达载体，表达分泌蛋白。（8）减轻细胞的代谢负荷 特别是毒性蛋白。使用诱导启动子合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源
21、基因高效表达的关系。 19、常用的组成型启动子 花椰菜花叶病毒(CaMV)35S 启动子、胭脂碱合成酶基因 (Nos)启动子、章鱼碱合成酶基因(Ocs) 启动子20、报告基因是指用于检测与其组装在一起的外源基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因。常用的有：冠瘿碱合成酶基因；-葡萄糖苷酸酶基因 (GUS)荧光素酶基因或 GFP 基因 第四章 核酸操作的基本技术1、核酸提取纯化的基本程序：细胞破碎； 抽提(除去蛋白质、多糖、脂、其他核酸等杂质)； 核酸沉淀(乙醇、异丙醇)；核酸溶解与保存。 2、核酸的凝胶电泳原理：在一定条件下，核酸分子的磷酸基团呈离子化状态，当被放在电场中，它们就会向正极方向迁移
22、。在无反应活性的稳定的支持介质中，其迁移速度与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，与分子的磨擦系数成反比(分子大小、介质粘度系数) 。因此，在同一凝胶中、一定电场强度下，核酸分子的迁移速度取决于核酸分子大小和构型。3、染色（P102、103）4、将具有核酸印迹的膜与带有放射性标记或其它标记的 DNA 或 RNA 探针杂交。故也称印迹杂交。5、探针(probe)是指分子杂交中经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的 DNA 或 RNA 片段。探针：（1）DNA 探针 双链 DNA 探针，单链 DNA 探针（2）RNA 探针 单链 RNA 探针 或放射性标记探针(同位素标记探针)和非
23、放射性标记探针(非同位素标记探针)6、同位素标记探针 酶促标记法：切口平移标记法；制备双链 DNA 探针。随机引物标记法；制备双链 DNA、单链 DNA、RNA 探针。操作简单方便，标记活性高，可达 108cpm/gDNA。PCR 标记法。探针纯化：乙醇沉淀法、葡聚糖凝胶柱层析法。杂交检测：放射自显影。 7、核酸分子杂交的类型：Southern DNA 印迹杂交(Southern 印迹杂交、Southern blotting)；Northern RNA 印迹杂交(Northern 印迹杂交，Northern blotting)；斑点印迹杂交(dot blotting)；原位杂交(hybridi
24、zation in situ)。8、SouthernDNA 印迹杂交操作步骤：DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳分离；凝胶预处理；包括酸脱嘌呤、碱变性等；凝胶中 DNA 印迹到杂交膜上；毛细管虹吸印迹法、电印迹法、真空印迹法。DNA 固定；80烤膜、紫外交联。 杂交；包括预杂交(封闭剂) 、探针杂交、洗脱。杂交信号检测；放射自显影(2ng DNA/带)或显色反应。结果分析。 第五章 聚合酶链式反应1、PCR 原理：遵循 DNA 体内复制原理，半保留式扩增；扩增序列取决于设计一对引物(正向引物、反向引物)，有效扩增长度为 2kb 左右；扩增循环包含变性、退火、延伸 3 个阶段；3035 个循环后，目标
25、序列呈指数级扩增(2n-2)。2、平台效应是指 PCR 反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线变得平坦的现象。引起平台效应的因素：dNTP 或引物等消耗殆尽； 酶活性逐渐降低； 最终产物的阻化作用( 焦磷酸盐、双链 DNA)； 非特异性产物与模板的竞争作用； 在高产物浓度下产物变性不完全； 低浓度的非特异产物开始大量扩增。3、引物设计的一般原则（P116）4、逆转录 PCR( RT-PCR)是指先以 mRNA，以 oligo(dT)n 为引物在逆转录酶作用下合成 cDNA 第一链，然后用已知一对引物扩增 cDNA 片段的技术。5、快速扩增 cDNA 末端(RACE，锚定 PCR)（
26、P121）6、反向 PCR 的定义、锅柄 PCR 的原理（P123） 7、荧光定量 PCR (实时定量 PCR) 荧光染料(EB)：结合双链 DNA 会使荧光增强，但结合无特异性。 荧光标记探针(见图)：利用 Taq 酶的外切酶活性，扩增时切断探针释放出荧光基团，使荧光增强。特异性强。用途：检测病原菌、基因表达。 第六章 基因文库的构建与目的基因的获得1、基因组文库构建的程序：（1）基因组 DNA 克隆片段的制备 高分子量基因组 DNA 的提取；DNA 克隆片段的制备 （2）载体 DNA 片段的制备 酶切；一般用 BamHI，产生与基因组 DNA 克隆片段相匹配的黏性末端。碱性磷酸酶处理； 载
27、体 DNA 片段纯化。有机溶剂抽提乙醇沉淀法、蔗糖密度梯度离心法。 （3）基因组 DNA 片段与载体的连接( 重组 DNA 分子的构建) 连接效率主要受插入片段与载体的摩尔数比以及 DNA 片段总浓度的影响。因此，应通过连接预试验确定连接反应中载体臂和插入片段的用量。 （4）重组 DNA 分子导入受体细胞。 对于 噬菌体载体、黏粒载体，重组 DNA 分子在体外包装成噬菌体颗粒，以噬菌体感染的方式将重组的 DNA 分子导入到大肠杆菌中。效率高，达1.8108pfu/g DNA。对于 YAC 载体，采用电激法导入重组 DNA 分子。（5）转化体的筛选培养及基因组文库的获得。 （6）基因组文库的扩增
28、、分装及保存。2、cDNA 文库的构建： cDNA 文库是指某生物、组织或细胞所有 cDNA 的的克隆群体。包括组织特异性cDNA 文库、区域特异性 cDNA 文库。（1）用于构建 cDNA 文库的载体及载体片段制备；（2）mRNA 的提取及其完整性的确定；（3）cDNA克隆片段的制备；（4）cDNA 克隆片段与载体片段的连接及检测；（ 5）重组 cDNA 分子导入受体细胞；（6）转化体筛选培养及 cDNA 文库生成；（7）cDNA 文库的扩增、分装及保存。值得注意的是：在构建 cDNA 文库时，如果用人工接头法，在酶切之前要用甲基化酶保护 cDNA 中的相应酶切位点。一般情况下无需构建原核细
29、菌的 cDNA 文库。 3、获得目的基因的主要途径：序列已知的基因筛选基因组文库；筛选 cDNA 文库；PCR 扩增目的基因；人工合成法；未知序列的基因 差异克隆法；图位克隆法；转座子标签法；T-DNA 标签法；基因组计划。第七章 DNA 体外重组与重组分子导入受体细胞1、连接子(linker)：人工合成的含有一种或几种限制内切酶位点的平头末端双链 DNA 片段，812bp 长。2、外源基因片段与载体的连接方式：（1）黏性末端连接法(黏性末端法) ；（2）平头末端连接法(平头末端法)；（3）同聚物加尾连接法(同聚物加尾法、同聚物接尾法)；（4）人工接头连接法(人工接头法) 。第八章 重组子(转
30、化子或克隆 )的筛选与鉴定 1、重组子是指目的 DNA 片段与载体连接形成重组 DNA 分子。转化子(转化体、克隆)是指导入外源 DNA 后获得了新的遗传标志的受体细胞或由此而来的组织、生物体。 第九章 外源基因的表达1、真核基因在大肠杆菌中正确表达的基本条件： 外源基因必须是其 cDNA；置于原核细胞的强启动子和 SD 序列控制之下； 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的阅读框架；修饰密码子为大肠杆菌偏爱密码子；联同分子伴侣一起表达或以细菌融合蛋白的形式进行表达。2、真核细胞表达系统表达外源基因的特点：真核细胞具有 RNA 剪接功能，可以直接使用从基因组中分离克隆的基因；真核细胞的翻译起
31、始不同于原核生物，不需要在表达载体的克隆位点上游设置 SD 序列；真核细胞具有翻译后修饰加工，表达的外源蛋白具有生物活性；外源基因导入真核细胞的效率较低，其在染色体 DNA 上的整合是随机的和自发的，目前还无法控制整合的位置和适当的拷贝数；真核细胞的培养要求较高，大量生产比较困难，成本也高。 第十章 植物基因工程1、T-DNA 是指农杆菌质粒上一段能转移并整合到植物染色体上的 DNA 片段。 2、边界序列：25bp，TGACACGATATAT TGGCGGGTAAAC右边界序列是完全保守的，对 T-DNA 转移是必须的。3、T-DNA 转移至植物细胞的机理( 农杆菌介导转化的机理) 植物创伤反
32、应与农杆菌对植物细胞的识别和附着；信号分子的释放积累与 VirA 蛋白的感应； VirG 蛋白激活与 vir 基因的诱导表达； T-链复合体的形成；T-链复合体的跨膜转运；T-DNA 整合到植物染色体上。 4、T-链是指 vir 基因被诱导表达后加工 T-DNA 而产生的单链 T-DNA。T-链复合体是指结合了 VirD2、VirE2 蛋白的 T-链。 5、三亲交配法中的三亲指含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁移质粒的大肠杆菌、含有 Ti 质粒的农杆菌 6、植物转化载体系统，主要有共整合载体系统（由卸甲 Ti 质粒载体、中间表达载体组成） 、双元载体系统（由微型质粒、辅助 Ti 质粒组成） 、
33、隔端载体系统（由卸甲 Ti 质粒载体和中间表达载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关的 T-DNA 左右边界序列分别位于两个载体上） 。7、植物基因转移的方法 农杆菌介导法一般程序：制备工程农杆菌侵染液 农杆菌侵染外植体 共培养 筛选与分化培养 获得抗性植株 分子检测 转基因植株 8、转基因沉默是指转入植物的外源基因不表达或表达水平很低的现象。转基因沉默的原因及其克服措施分为转录沉默、转录后沉默，或分为同源依赖性沉默、位置依赖性沉默。同源依赖性沉默是由于转基因出现多拷贝而发生转基因之间或转基因与内源基因之间相互作用而诱发的转基因沉默。位置依赖性转基因沉默是指由于转基因整合到宿主基因
34、组的一定位置而引起的转基因失活。 DNA 甲基化 常发生在外源基因的启动子区，是转录沉默或位置依赖性转基因沉默的直接诱因。导致外源基因失活的机制：a、甲基化序列与甲基化 DNA 结合蛋白结合，后者再与协同抑制蛋白 mSin3A、组蛋白去乙酰酶等形成多蛋白抑制复合物，阻碍了转基因启动子与转录因子的接触，从而引起转录抑制。b、甲基化导致 DNA 构象转变为 Z 型，从而降低转录水平，造成转基因失活。 多拷贝整合 重复诱导的转基因沉默是指外源基因多拷贝整合而引起转基因表达水平降低或失活的现象。顺式失活是指相互串联或紧密连锁的转基因间产生的失活。反式失活是指非同一染色体上转基因间引起的失活。导致外源基
35、因失活的机制：a、转基因间异位配对，形成三链或四链结构，导致染色体异染色质化，阻碍了转录因子与转基因启动子的结合，从而使转录受到抑制；b、转基因 mRNA 的特异降解(空载 tRNA 触发机制、反义 RNA 触发机制) 。 位置效应a、外源基因整合在异染色质区和转录不活跃区域(占植物基因组 90%)；b、外源基因整合在非等容线位点，被宿主的特定识别机制识别而被甲基化，导致转基因沉默。后成修饰作用后成修饰作用是指转基因的表达在个体发育的某一阶段受到细胞内因子的修饰作用而关闭。 与内源基因竞争性结合某些转录、翻译因子克服转基因沉默的措施：a、单拷贝插入；b、建立位点特异整合的转基因体系；c、采用非甲基化启动子；d、外源基因的密码子优化；e、将核基质结合区序列置于外源基因两侧，使其成为一个独立的表达结构；f、筛选稳定表达的转基因植株。 9、反义 RNA 技术是指将某反义基因转入植物而抑制其相应内源基因表达的技术。 第十一章 动物基因工程1、动物转基因操作的一般程序：目的基因的分离与克隆；表达载体的构建；受体细胞的获得；转基因的导入与转基因胚胎的获得；受体动物的选择与转基因胚胎的移植；转基因整合表达的检测与转基因动物的获得；转基因动物的选育或转基因表达产物的分离纯化。
