基因工程总结.doc

1、主 要 内 容 :第 一 章 基 因 操 作 的 基 本 技 术核 酸 制 备 ； 质 粒 及 质 粒 载 体 ； 细 菌 的 转 化 ； 凝 胶 电 泳 ； 核 酸探 针 ； 限 制 性 内 切 酶 、 酶 切 图 谱 及 分 子 克 隆 用 酶第 二 章 PCR 技 术第 三 章 核 酸 分 析 与 合 成第 四 章 噬 菌 体 载 体 及 粘 粒第 五 章 目 的 基 因 的 准 备 和 重 组 及 重 组 子 的 鉴 定第 六 章 基 因 在 原 核 及 真 核 体 系 中 的 表 达真 核 基 因 在 大 肠 杆 菌 中 的 表 达 ； 哺 乳 动 物 基 因 工 程 ； 研 究 D

2、NA与 蛋 白 质 相 互 作 用 的 方 法第 七 章 植 物 基 因 工 程第 八 章 基 因 工 程 研 究 进 展人 类 基 因 组 计 划 ； 基 因 诊 断 、 基 因 治 疗 和 转 基 因 ； 反 义 技 术序 言 ：1.什 么 是 基 因 工 程 ？ 基 因 工 程 是 如 何 诞 生 的 ？答 ： 在 体 外 将 核 酸 分 子 插 入 病 毒 、 质 粒 或 其 他 载 体 分 子 中 ， 构 成 遗 传物 质 的 新 组 合 ， 并 使 之 掺 入 到 原 先 没 有 这 类 分 子 的 宿 主 细 胞 中 ， 并 能持 续 稳 定 的 繁 殖 。2.基 因 工 程 的

3、 两 个 基 本 特 征 ？答 ： （ 1） 跨 越 天 然 的 物 种 屏 障 （ 2） 确 定 的 DNA 扩 增3.基 因 工 程 的 步 骤 和 内 容 ？答 ： 酶 切 分 离 目 的 基 因 重 组 DNA 分 子 转 移 至 受 体 细 胞 增 殖 获得 筛 选 目 的 重 组 子 ( 提 取 目 的 基 因 供 进 一 步 研 究 重 组 目 的 基 因 功 能表 达 )4.基 因 工 程 可 以 应 用 于 哪 些 方 面 ?答 ： (1)带 来 体 外 蛋 白 质 化 学 的 革 命 :甲 型 干 扰 素 ， 红 细 胞 生 成 素 。（ 2） 对 检 测 技 术 的 贡

4、献 ： 提 供 大 量 高 纯 靶 ， 提 高 准 确 性 ； 病 原 体 检出 （ HCV HBV HIV） ； 遗 传 病 诊 断 。（ 3） 直 接 的 遗 传 性 疾 病 治 疗 和 生 物 体 改 造 ： 转 基 因 动 植 物 。（ 4） 促 进 对 生 命 现 象 本 质 机 理 的 研 究 ： 胰 岛 素 基 因 与 糖 尿 病 、 癌 基 因与 抗 癌 基 因 。5.什 么 是 “安 全 ”的 宿 主 载 体 体 系 ？答 ： 失 去 自 我 迁 移 能 力 ， 可 以 是 营 养 缺 陷 性 ， 在 自 然 环 境 下 无 法 生 存 。第 一 章 基 因 操 作 基 本

5、技 术1、 提 取 细 胞 总 RNA 的 原 则 是 什 么 ？ 如 何 实 施 ？ 为 什 么 ?答 : 原 则 ： 抑 制 RNA 酶 活 性实 施 ： （ 1） 高 温 ： 180 ， 2 小 时 ， 灭 活 RNase（ 2） 二 乙 基 焦 炭 酸 乙 酯 （ DEPC） ,油 状 有 毒 , 是 一 种 强 烈 但 不 彻 底 的RNA 酶 抑 制 剂 。 它 使 蛋 白 质 变 性 ， 从 而 抑 制 酶 的 活 性 。（ 3） 使 用 对 RNase 有 强 烈 乙 酯 作 用 的 细 胞 裂 解 剂 ， 如 盐 酸 胍 、 异 硫氰 胍 （ 裂 解 细 胞 、 抑 制 酶

6、活 性 、 解 聚 核 糖 体 ）（ 4） 带 手 套 、 口 罩 ： 阻 断 RNA 酶 来 源 ， 加 少 污 染 机 会 。（ 5） 季 节 因 素 （ 温 度 ） ： RNase 降 解 RNA 温 度 高 活 性 高 ， 需 要 低 温进 行 。2.如 何 进 行 总 RNA 制 品 质 量 控 制 ？答 ：1） RNA 的 浓 度 和 纯 度 测 定A260nm 1 OD=40 g/ml RNA要 求 A260nm/A280nm=2.0 (1.7-2.0 或 2.0) A260nm/A230nm 2.02） RNA 的 完 整 性 变 性 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 28S

7、： 18S2： 13） 总 RNA 制 品 的 保 存溶 液 法 （ TE 或 0.5%SDS 方 便 但 不 稳 定 )悬 液 法 （ 溶 液 加 3V 乙 醇 可 靠 但 不 方 便 ） 3.染 色 体 DNA 制 备 的 原 则 是 什 么 ？ 各 有 哪 些 主 要 试 剂 ？ 作 用 ？答 ： 原 则 ： 祛 除 蛋 白 及 细 胞 碎 片 ， 祛 除 RNA， 保 持 DNA 分 子 完 整 。主 要 试 剂 及 作 用 ： SDS（ 破 坏 细 胞 膜 结 构 、 变 性 蛋 白 质 、 解 聚 ）EDTA（ 抑 制 酶 活 性 ） Proteinase K（ 蛋 白 酶 消 化

8、 蛋 白 质 ）4.如 何 进 行 DNA 样 品 的 鉴 定 ？答 ： A260nm 1 OD=50 g/ml DNA要 求 A260nm/A280nm 1.7 A260nm/A230nm 2.05. 有 哪 些 方 法 可 以 进 行 DNA 片 段 的 制 备 ？ 是 如 何 进 行 的 ？答 ： （ 1） 低 熔 点 琼 脂 糖 （ 羟 乙 基 60C-65 C 熔 化 ， 结 果 较 纯 ）（ 2） 透 析 袋 法 ： 需 要 把 样 品 浓 缩 ， 把 核 酸 沉 淀 ， 而 去 掉 缓 冲 液 。（ 3） 苯 酚 抽 提 法（ 4） 反 复 冻 融 法 ： 多 次 冻 融 使 凝

9、 胶 收 到 破 坏 ， 释 放 其 中 DNA， 但 回收 率 低（ 5） 电 洗 脱 法 （ 6） 硝 酸 纤 维 素 膜 离 心 法 （ 7） 试 剂 盒6.什 么 是 质 粒 ？ 质 粒 有 几 类 ？答 ： 质 粒 是 一 类 亚 细 胞 有 机 体 ， 存 在 于 细 胞 质 中 独 立 于 染 色 体 的 遗 传成 分 ， 由 环 状 双 链 DNA 组 成 的 复 制 子 。分 为 ： F 质 粒 （ 致 育 质 粒 ， 可 以 通 过 接 合 ， 在 供 体 和 受 体 间 传 递 遗 传 物 质 ） R 质 粒 （ 抗 性 质 粒 ， 带 有 抗 性 基 因 ， 可 使 宿

10、 主 菌 对 某 些 抗 菌 素 产 生抗 性 ） Col 质 粒 ： 带 有 编 码 大 肠 杆 菌 素 的 基 因 。 降 解 质 粒 ： 可 使 宿 主 代 谢 特 殊 分 子 侵 入 性 质 粒 ： 使 宿 主 菌 具 有 致 病 能 力7.什 么 是 质 粒 的 转 移 ？ 什 么 是 质 粒 的 迁 移 ？ 迁 移 原 理 ？答 ： 质 粒 的 转 移 ： 从 一 个 细 胞 自 我 的 转 移 到 原 来 不 存 在 这 种 质 粒 的 另一 个 细 胞 去 。质 粒 的 迁 移 ： 由 共 存 的 接 合 型 质 粒 引 发 非 接 合 型 质 粒 的 转 移 过 程 。原 理

11、 ： 当 相 容 性 的 接 合 质 粒 和 非 接 合 质 粒 在 同 一 细 胞 中 ， 非 接 合 质 粒中 mob 编 码 的 核 酸 酶 作 用 其 特 异 位 点 bom， 使 bom 位 点 发 生 单 链 断裂 而 出 现 缺 口 ， 构 象 转 变 为 缺 口 环 状 构 象 。 当 有 接 合 性 质 粒 中 F 因 子能 够 导 致 性 须 的 合 成 ， 提 供 转 移 装 置 ， 则 可 以 转 移 。 如 果 没 有 ， 缺 口可 能 还 原 维 持 两 种 构 象 的 动 态 平 衡 。8.掌 握 质 粒 拷 贝 数 的 定 义 ？ 质 粒 的 复 制 类 型 ？

12、答 ： 定 义 ： 生 长 在 标 准 培 养 条 件 下 ， 每 个 细 菌 细 胞 中 所 含 有 的 质 粒DNA 分 子 的 数 目 。 非 标 准 培 养 条 件 下 ， 每 个 细 菌 细 胞 染 色 体 平 均 具有 的 质 粒 DNA 分 子 的 数 目 。类 型 ： 一 类 是 严 紧 型 质 粒 ， 当 细 胞 染 色 体 复 制 一 次 时 ， 质 粒 也 复 制 一次 ， 每 个 细 胞 内 只 有 1 2 个 质 粒 ； 另 一 类 是 松 弛 型 质 粒 ， 当 染 色 体 复制 停 止 后 仍 然 能 继 续 复 制 ， 每 一 个 细 胞 内 一 般 有 20

13、个 左 右 质 粒 。9.什 么 是 质 粒 的 不 相 容 性 ？答 ： 在 没 有 选 择 压 力 的 情 况 下 ， 两 种 亲 源 关 系 密 切 的 不 同 质 粒 不 能 在同 一 个 宿 主 细 胞 中 稳 定 存 在 。10.掌 握 用 作 克 隆 载 体 的 基 本 条 件 是 什 么 ？ 为 什 么 ？答 ： (i) 具 若 干 限 制 酶 单 一 识 别 位 点 ： 可 提 供 多 种 选 择 ， 具 有 多 个 同一 种 酶 切 位 点 则 可 能 被 切 碎 (ii) 具 有 复 制 起 点 ： 可 导 入 宿 主 细 胞 ， 也是 质 粒 自 我 增 值 必 不 可

14、 少 条 件 （ iii） 具 有 选 择 标 记 ： 便 于 筛 选 （ iv） 具有 较 小 的 分 子 量 和 较 高 的 拷 贝 数 ： 操 作 简 单 ， 可 携 带 较 大 片 段 的 基 因 ，并 有 利 于 载 体 的 稳 定 。11.掌 握 LacZ 的 筛 选 原 理 是 什 么 ？答 ： 是 重 组 子 筛 选 的 一 种 方 法 ： 是 根 据 载 体 的 遗 传 特 征 筛 选 重 组 子 ，如 -互 补 、 抗 生 素 基 因 等 。 现 在 使 用 的 许 多 载 体 都 带 有 一 个 大 肠 杆 菌的 DNA 的 短 区 段 ， 其 中 有 -半 乳 糖 苷

15、酶 基 因 （ lacZ） 的 调 控 序 列 和前 146 个 氨 基 酸 的 编 码 信 息 。 在 这 个 编 码 区 中 插 入 了 一 个 多 克 隆 位 点（ MCS） ， 它 并 不 破 坏 读 框 ， 但 可 使 少 数 几 个 氨 基 酸 插 入 到 -半 乳 糖苷 酶 的 氨 基 端 而 不 影 响 功 能 ， 这 种 载 体 适 用 于 可 编 码 -半 乳 糖 苷 酶 C端 部 分 序 列 的 宿 主 细 胞 。 因 此 ， 宿 主 和 质 粒 编 码 的 片 段 虽 都 没 有 酶 活性 ， 但 它 们 同 时 存 在 时 ， 可 形 成 具 有 酶 学 活 性 的

16、蛋 白 质 。 这 样 ， lacZ基 因 在 缺 少 近 操 纵 基 因 区 段 的 宿 主 细 胞 与 带 有 完 整 近 操 纵 基 因 区 段 的质 粒 之 间 实 现 了 互 补 ， 称 为 -互 补 。 由 -互 补 而 产 生 的 LacZ+细 菌 在诱 导 剂 IPTG 的 作 用 下 ， 在 生 色 底 物 X-Gal 存 在 时 产 生 蓝 色 菌 落 ， 因而 易 于 识 别 。 然 而 ， 当 外 源 DNA 插 入 到 质 粒 的 多 克 隆 位 点 后 ， 几 乎不 可 避 免 地 导 致 无 -互 补 能 力 的 氨 基 端 片 段 ， 使 得 带 有 重 组 质

17、 粒 的 细菌 形 成 白 色 菌 落 。 这 种 重 组 子 的 筛 选 ， 又 称 为 蓝 白 斑 筛 选 。 如 用 蓝 白斑 筛 选 则 经 连 接 产 物 转 化 的 钙 化 菌 平 板 37 温 箱 倒 置 培 养 12-16hr 后 ，有 重 组 质 粒 的 细 菌 形 成 白 色 菌 落 。12、 掌 握 以 碱 裂 解 法 提 取 质 粒 主 要 用 什 么 试 剂 ？ 各 有 什 么 作 用 ？ 几 大步 骤 中 各 会 发 生 怎 样 的 现 象 ？答 ：溶 液 I（ 溶 液 呈 黄 色 悬 浊 液 ） ： 葡 萄 糖 （ 维 持 渗 透 压 ， 保 持 结 构 完 整性

18、 、 用 于 悬 浮 ） 、 Tris（ 维 持 一 定 粒 子 强 度 及 PH 值 ） 、 EDTA（ 螯 合金 属 离 子 ， 抑 制 DNA 酶 的 作 用 ） 。溶 液 II（ 溶 液 变 粘 稠 ， 流 动 性 下 降 ） ： NaOH（ 高 浓 度 ， 释 放 出 的 物质 在 强 碱 条 件 下 变 性 形 成 沉 淀 ） 、 SDS（ 去 膜 剂 ， 使 膜 溶 解 ， 释 放 细胞 内 物 质 ）溶 液 III（ 很 多 白 色 沉 淀 ， 流 动 性 较 好 ） ： KAC pH4.8（ 中 和 溶 液 II 的碱 性 ， 染 色 体 DNA 不 能 复 性 ， 而 质

19、粒 是 小 分 子 可 以 复 性 重 新 溶 解 ，以 此 来 分 离 染 色 体 DNA 与 质 粒 ， 剩 下 的 沉 淀 是 细 胞 碎 片 和 不 能 溶 解的 DNA）进 一 步 ： CsCl（ 密 度 梯 度 离 心 ） 、 NaCl（ 密 度 梯 度 离 心 ） 、Sepharose（ 凝 胶 过 滤 ） 。14、 掌 握 什 么 是 感 受 态 ？ 什 么 是 转 化 ？ ca2+诱 导 感 受 态 的 原 理 是 什 么 ？答 ：感 受 态 ： 在 特 殊 处 理 或 正 常 生 长 的 某 个 时 期 ， 细 胞 的 一 种 敏 化 的 可 以接 受 外 源 DNA 的

20、状 态 。自 然 条 件 下 的 转 化 ： 一 种 细 菌 菌 株 由 于 捕 获 了 来 自 另 一 种 细 菌 菌 株 的DNA 而 导 致 性 状 特 征 发 生 遗 传 性 改 变 的 生 命 过 程 。原 理 ： Ca2+诱 导 的 完 整 细 胞 的 转 化 适 用 于 革 兰 氏 阴 性 细 菌 （ 如 大 肠杆 菌 等 ） ， 其 原 理 是 Ca2+与 细 菌 外 膜 磷 脂 在 低 温 下 形 成 液 晶 结 构 ，后 者 经 热 脉 冲 发 生 收 缩 作 用 ， 使 细 胞 膜 出 现 空 隙 。15.什 么 是 电 泳 ？ 如 何 制 备 RNA 变 性 凝 胶 ？

21、答 ： （ 1） 蛋 白 质 核 酸 等 大 分 子 在 电 场 的 作 用 下 ， 在 缓 冲 液 中 涌 动 的现 象 。 原 理 ： 由 于 合 算 分 子 带 负 电 ， 置 于 电 场 中 的 分 子 以 一 定 的 速 度移 向 适 当 电 极 。 迁 移 率 （ 迁 移 速 度 ） 与 电 场 强 度 和 分 子 携 带 电 荷 成 正比 ， 与 分 子 的 摩 擦 系 数 成 反 比 （ 与 分 子 的 大 小 、 极 性 、 介 质 粘 度 有 关 ）， 从 而 把 不 同 分 子 分 开 。（ 2） 甲 酰 胺 凝 胶 尿 素 凝 胶 羟 甲 基 汞 凝 胶16.掌 握 聚

22、 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 的 特 点 。答 ： 分 辨 力 高 、 容 量 大 （ 10ug） 、 回 收 片 段 纯 度 高 。 但 制 备 时 间 长 。17.掌 握 PFGE 的 原 理 和 应 用 。答 ： 脉 冲 电 场 凝 胶 电 泳 。 原 理 ： 制 备 染 色 体 长 片 段 加 在 琼 脂 糖 凝胶 上 的 电 场 方 向 、 电 流 大 小 及 作 用 时 间 交 替 变 化 ， 两 电 场 方 向 垂 直 ，DNA 分 子 的 迁 移 方 向 随 所 用 的 电 场 方 向 周 期 性 变 化 而 不 断 改 变 。 特点 ： 施 加 交 变 电 场 ， 分 离

23、 分 子 大 小 范 围 5kb2Mb， 脉 冲 时 间 定 向时 间18.影 响 琼 脂 糖 凝 胶 DNA 电 泳 的 因 素 有 哪 些 ？答 ： （ 1） DNA 分 子 的 大 小 （ 2） 琼 脂 糖 浓 度 （ 3） DNA 的 构 象 ： I 超螺 旋 II 开 环 III 线 状 （ 4） 电 压 （ 5） 嵌 入 染 料 （ 6） 离 子 强 度19、 什 么 是 核 酸 探 针 ？ 用 核 酸 作 探 针 的 原 因 。 核 酸 探 针 的 特 性 。答 ： 定 义 ： 能 识 别 特 异 碱 基 序 列 的 有 标 记 的 一 段 单 链 DNA(或 RNA)分子 ，

24、一 段 与 被 测 定 的 核 苷 酸 序 列 （ 靶 序 列 ） 互 补 的 带 标 记 的 单 股 核 苷酸 。原 因 ： 信 息 量 丰 富 ， 不 同 生 物 含 可 区 别 的 DNA 序 列 ， 稳 定 性 （ 不 像蛋 白 等 不 易 保 存 ）特 性 ： 一 般 为 单 链 探 针 ： 杂 交 速 度 快 /效 率 高 ， 浓 度 高 ， 可 进 行 标 记 ，可 检 测 点 突 变 。 敏 感 性 高 、 特 异 性 强 、 简 便 。20、 掌 握 核 酸 探 针 的 标 记 方 法 及 其 原 理 。答 ： （ 1） 切 口 平 移 ： 限 量 DNase I 在 待 标

25、 记 的 双 连 DNA 的 每 一条 连 上 产 生 若 干 个 单 连 缺 口 ;在 DNA 聚 合 酶 I 的 作 用 下 5 3外 切 ，并 在 5 3合 上 新 底 物 （ 探 针 ） ， 标 记 一 条 链 。（ 2） 末 端 转 移 。 （ T4DNA 聚 合 酶 特 性 ： 在 无 dNTP 时 ， 可 以 从 任 何3-OH 外 切 ； 在 四 中 dNTP 均 存 时 ， 聚 合 活 性 占 主 导 地 位 ） 首 先 在无 dNTP 时 ， 用 T4DNA 聚 合 酶 作 用 下 ， 序 列 降 解 产 生 的 两 个 突 出 的末 端 ； 然 后 终 止 加 入 dNT

26、P， 有 些 加 标 记 ， 有 些 不 加 ， 则 T4DNA 聚合 酶 表 现 聚 合 作 用 。（ 3） 随 机 引 物 标 记 ： 引 物 很 短 ， 仅 留 个 碱 基 ， 这 样 在 引 物 上 找 到 的接 合 位 点 多 ， 呈 现 随 机 性 ； DNA 聚 合 酶 不 具 有 从 头 合 成 的 能 力 ， 必须 要 有 引 物 添 加 在 3端 羟 基 上 ， 标 记 出 来 的 探 针 是 双 链 。（ 4） 体 外 转 录 ： 非 细 胞 状 态 下 完 成 转 录 ， 借 助 一 定 的 载 体 及 外 源DNA 插 入 载 体 的 克 隆 位 点 ， 采 用 合

27、适 的 限 制 性 内 切 酶 将 载 体 线 性 化 ，上 游 启 动 子 起 始 转 录 ， 在 RNA 聚 合 酶 的 作 用 下 以 带 标 记 的 dNTP 为底 物 合 成 新 链 。21、 掌 握 核 酸 探 针 的 分 子 杂 交 类 型 、 原 理 及 其 比 较 和 适 用 性 。答 ： 原 理 ： 分 子 杂 交 是 通 过 配 对 碱 基 对 之 间 的 非 共 价 键 （ 主 要 是 氢 键 ）结 合 ， 从 而 形 成 稳 定 的 双 链 区 。分 类 ： Southern 印 迹 杂 交 （ DNA） 、 Northern 印 迹 杂 交 （ RNA） 、 斑点

28、杂 交 （ 操 作 快 ， 较 为 粗 略 ） 、 原 位 杂 交 （ 针 对 总 DNA， 可 用 于 菌落 、 噬 菌 斑 、 组 织 ）22、 非 放 射 性 标 记 物 质 有 什 么 ？ 非 放 射 性 显 示 体 系 是 如 何 工 作 的 ？答 ： 光 促 生 物 素 标 记 、 酶 促 生 物 素 标 记 、 酶 促 半 抗 原 标 记 、 化 学 催 化酶 标 记24、 掌 握 II 型 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 特 性 和 切 割 特 性 。 什 么 是 同 尾 酶 ？答 ： 识 别 特 性 :识 别 由 4-8 个 核 苷 酸 组 成 的 呈 回 文 结 构 的

29、 特 定 序 列 。 切割 特 性 ： 产 生 粘 性 端 或 钝 端 。 粘 性 末 端 分 为 5突 出 （ 5有 几 个 游 离碱 基 ） 、 3突 出 。同 尾 酶 （ isocaudomers） ： 来 源 不 同 的 限 制 酶 ， 识 别 及 切 割 序 列 各 不相 同 ， 但 却 能 产 生 出 相 同 的 粘 性 末 端 ， 这 类 限 制 酶 称 为 同 尾 酶 。25、 掌 握 II 型 限 制 性 内 切 酶 的 识 别 特 性 与 切 割 片 段 大 小 之 间 的 关 系 。28、 什 么 是 星 号 活 力 ？ 产 生 星 号 活 力 的 原 因 。答 :星 号

30、 活 力 （ star activity） ： 非 标 准 反 应 条 件 下 ， 内 切 酶 识 别 切 割 能力 下 降 ， 识 别 特 异 性 下 降产 生 原 因 ： 甘 油 （ 限 制 性 内 切 酶 保 存 在 甘 油 中 ） 、 盐 （ 来 自 于 样 品 ，一 般 可 以 被 除 去 ） 、 PH、 有 机 试 剂 （ 可 能 在 粗 提 样 品 时 被 加 入 而 未除 净 ） ； 酶 浓 度 大 于 10%时 会 引 起 星 号 活 力 ， 故 不 能 多 加 ； 酶 质 量 不好 也 易 产 生 星 号 活 力 。30、 T4DNA 连 接 酶 的 功 能 及 其 用 途

31、 。答 ： （ 连 接 单 位 定 义 ： 16C 30内 能 使 20 l 体 系 中 5 g /HindIII 的 6 个 片 段 有 50%连 接 成 DNA 的 量 。 ）功 能 ： 5-P+3-OH 需 Mg2+ ATP用 途 ： （ 1） 同 酶 或 同 尾 酶 切 产 物 的 连 接 （ 2） 接 头 与 连 接 子 的 连 接（ 3） 末 端 改 造 后 的 平 端 连 接31、 什 么 是 接 头 ， 什 么 是 连 接 子 ？答 ： 接 头 ： 指 的 是 连 接 两 个 分 子 或 同 一 个 分 子 两 末 端 的 一 段 DNA 序列 ， 是 人 工 合 成 的 寡

32、核 苷 酸 ， 两 端 有 限 制 酶 识 别 序 列 。连 接 子 ： 指 的 是 合 成 的 具 有 限 制 性 酶 识 别 序 列 的 核 苷 酸 片 段 ,利 用 连 接子 时 ,将 其 与 外 源 DNA 片 段 连 接 后 ,用 相 应 的 酶 切 割 ,则 可 产 生 粘 性 末 端 。32、 碱 性 磷 酸 酶 、 S1 酶 、 Bal31 酶 、 Klenow 酶 的 功 能 及 其 用 途 是 什么 ？答 ：碱 性 磷 酸 酶 ： 去 磷 酸 化 防 止 载 体 自 连S1 酶 ： 切 割 单 链 末 端 修 饰 、 切 开 回 折 、 RNA 作 图Bal31 酶 ： 5

33、 3/3 5 外 切 诱 发 基 因 的 缺 失 突 变 、 酶 谱Klenow 酶 ： 末 端 放 射 性 标 记 DNA 聚 合 酶 I 大 片 段 ， 只 是 从 DNA聚 合 酶 I 全 酶 中 去 除 5 3外 切 酶 活 性 。 有 dNTP 情 况 下 ， 呈 现DNA 聚 合 酶 活 性 ， 在 没 有 dNTP 情 况 下 呈 现 外 切 酶 活 性第 二 章 PCR 技 术1、 什 么 是 PCR?其 原 理 什 么 ？ PCR 反 应 的 典 型 过 程 怎 样 ？答 : 定 义 ： 聚 合 酶 链 反 应 又 称 为 PCR 扩 增 技 术 ， 是 一 种 高 效 、

34、快 速 、特 异 性 的 体 外 DNA 聚 合 程 序 。 在 体 外 的 无 细 胞 体 系 中 模 拟 天 然 DNA复 制 过 程 的 使 目 的 DNA 的 量 增 加 的 反 应 。原 理 :类 似 于 DNA 的 天 然 复 制 过 程 ， 其 特 异 性 依 赖 于 与 靶 序 列 两 端 互补 的 寡 核 糖 核 苷 酸 引 物 。 PCR 由 变 性 退 火 延 伸 三 个 基 本 反 应步 骤 构 成 。步 骤 ： （ 1） 模 板 DNA 变 性 ： 模 板 DNA 经 加 热 至 94 左 右 一 定 时 间后 ， 使 模 板 DNA 双 链 或 经 PCR 扩 增

35、形 成 的 双 链 DNA 解 离 ， 使 之 成为 单 链 ， 以 便 它 与 引 物 接 合 ， 为 下 轮 反 应 作 准 备 。（ 2） 模 板 DNA 与 引 物 的 退 火 ： 模 板 DNA 经 加 热 变 性 成 单 链 后 ， 温度 降 至 55 左 右 ， 引 物 与 模 板 DNA 单 链 的 互 补 序 列 配 对 接 合 。（ 3） 引 物 的 延 伸 ： DNA 模 板 _引 物 结 合 物 在 TapDNA 聚 合 酶 的 作 用下 ， 以 dNTP 为 反 应 原 料 ， 靶 序 列 为 模 板 ， 按 碱 基 配 对 与 保 留 复 制 原理 ， 合 成 一

36、条 新 的 与 模 板 DNA 链 互 补 的 半 保 留 复 制 链 。重 复 循 环 变 性 _退 火 _延 伸 三 过 程 ， 就 可 获 得 更 多 的 “半 保 留 复 制 链 ”。2、 PCR 反 应 中 的 引 物 设 计 有 什 么 样 的 原 则 ？答 ： （ 1） 引 物 间 配 对 碱 基 不 能 超 过 六 个 ， 尤 其 是 3端 引 物 间 配 对 碱基 不 能 超 过 2 个 ； （ 2） 引 物 内 配 对 碱 基 不 超 过 6 个 ； （ 3） GC%， 所占 %比 低 ， 则 Tm 低 （ 4） 末 端 保 守 性 ： 引 物 3端 必 须 与 模 板 完

37、 全 匹配 （ 5） 兼 并 碱 基 （ 可 用 次 黄 嘌 呤 代 替 任 意 碱 基 ）3、 什 么 是 热 启 动 ？答 ： 指 在 PCR 反 应 中 ， 由 于 Taq 聚 合 酶 在 常 温 下 也 具 有 延 伸 引 物 的 活性 ， 因 此 为 保 证 扩 增 产 物 的 纯 度 ， PCR 反 应 的 主 要 成 分 （ 模 板 和 引 物等 ） 在 延 伸 前 才 加 入 。6、 难 于 扩 增 得 到 长 片 段 产 物 的 原 因 及 其 解 决 办 法 ？答 ： 原 因 ： （ 1） 3端 得 错 配 ： 此 种 情 况 在 生 物 体 内 也 存 在 ， 但 体 内

38、的 DNA 聚 合 酶 具 有 校 正 功 能 ， 而 用 于 PCR 扩 增 的 Taq 酶 不 具 这 种 功能 。 （ 2） 高 温 下 脱 嘌 呤 或 脱 嘧 啶 、 而 使 Taq 酶 不 能 通 过 （ 3） 反 应 添加 剂 、 PCR 循 环 参 数 、 模 板 的 完 整 性 （ 模 板 越 长 越 不 稳 定 ） 等 影 响（ 4） TaqDNA 聚 合 酶 会 自 动 脱 落 。解 聚 方 法 ： 发 展 新 酶 或 合 成 能 力 强 的 酶 ； 三 羟 甲 基 甘 氨 酸 可 增 加 PH稳 定 性 。8、 如 何 进 行 PCR 污 染 的 控 制 ？答 ： 设 阴

39、 阳 对 照 ； 操 作 分 区 ； 材 料 分 装 （ 小 包 装 ） ； 加 样 顺 序 ； 使 用专 门 仪 器 ； 重 复 实 验 。9、 如 何 判 断 PCR 产 物 的 特 异 性 ？答 ： PCR 产 物 是 否 为 特 异 性 扩 增 ， 其 结 果 是 否 准 确 可 靠 ， 必 须 对 其 进行 严 格 的 分 析 与 鉴 定 ， 才 能 得 出 正 确 的 结 论 。 PCR 产 物 的 分 析 ， 可 依据 研 究 对 象 和 目 的 不 同 而 采 用 不 同 的 分 析 方 法 。凝 胶 电 泳 分 析 ： PCR 产 物 电 泳 ， EB 染 色 紫 外 成 像

40、 仪 下 观 察 ， 初 步 判断 产 物 的 特 异 性 。 PCR 产 物 片 段 的 大 小 应 与 预 计 的 一 致 ， 特 别 是 多 重PCR， 应 用 多 对 引 物 ， 其 产 物 片 段 都 应 符 合 预 计 的 大 小 ， 这 是 起 码 条件 。琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 ： 通 常 应 在 1-2%的 琼 脂 糖 凝 胶 ， 供 检 测 用 。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 :6-10%聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 分 离 效 果 比 琼 脂 糖 好 ，条 带 比 较 集 中 ， 可 用 于 科 研 及 检 测 分 析 。酶 切 分 析 ： 根 据 PCR

41、 产 物 中 限 制 性 内 切 酶 的 位 点 ， 用 相 应 的 酶 切 、电 泳 分 离 后 ， 获 得 符 合 理 论 的 片 段 ， 此 法 既 能 进 行 产 物 的 鉴 定 ， 又 能对 靶 基 因 分 型 ， 还 能 进 行 变 异 性 研 究 。分 子 杂 交 ： 分 子 杂 交 是 检 测 PCR 产 物 特 异 性 的 有 力 证 据 ， 也 是 检 测PCR 产 物 碱 基 突 变 的 有 效 方 法 。Southern 印 记 杂 交 ： 在 两 引 物 之 间 另 合 成 一 条 寡 核 苷 酸 链 （ 内 部 寡 核苷 酸 ） 标 记 后 做 探 针 ， 与 PC

42、R 产 物 杂 交 。 此 法 既 可 作 特 异 性 鉴 定 ，又 可 以 提 高 检 测 PCR 产 物 的 灵 敏 度 ， 还 可 知 其 分 子 量 及 条 带 形 状 ，主 要 用 于 科 研 。斑 点 杂 交 ： 将 PCR 产 物 点 在 硝 酸 纤 维 素 膜 或 尼 膜 薄 膜 上 ， 再 用 内 部 寡核 苷 酸 探 针 杂 交 ， 观 察 有 无 着 色 斑 点 ， 主 要 用 于 PCR 产 物 特 异 性 鉴 定及 变 异 分 析 。核 酸 序 列 分 析 ： 是 检 测 PCR 产 物 特 异 性 的 最 可 靠 方 法 。10、 利 用 PCR 技 术 如 何 进

43、 行 点 突 变 ？答 : DNA 分 子 中 单 个 或 几 个 碱 基 的 变 化 可 以 使 遗 传 的 结 构 发 生 改 变 。11、 什 么 是 锚 定 PCR？ 应 用 于 怎 样 的 研 究 ？答 ： 用 于 扩 增 已 知 一 端 序 列 的 目 的 DNA。 在 未 知 序 列 一 端 加 上 一 段多 聚 dG 的 尾 巴 ， 然 后 分 别 用 多 聚 dC 和 已 知 的 序 列 作 为 引 物 进 行 PCR扩 增 。 锚 定 PCR（ Anchored PCR, A-PCR） 主 要 用 于 分 析 具 有 可 变 末 端 的DNA 序 列 ， Loh 等 用 A

44、-PCR 对 人 外 周 血 淋 巴 细 胞 T 细 胞 受 体 -链 的mRNA 的 多 变 性 进 行 了 分 析 。 先 可 用 于 T 细 胞 、 肿 瘤 及 其 它 部 位 抗 体基 因 的 研 究 。12、 什 么 是 不 对 称 PCR？ 应 用 于 怎 样 的 研 究 ？答 ： 用 不 等 量 的 一 对 引 物 ， PCR 扩 增 后 产 生 大 量 的 单 链 DNA(SSDNA).这对 引 物 分 别 称 为 非 限 制 引 物 与 限 制 性 引 物 ， 其 比 例 一 般 为 100 1。 得 到 单 链 ， 更 适 宜 测 序 ， 单 链 还 可 作 为 探 针 。

45、13、 什 么 是 表 达 子 PCR? 应 用 于 怎 样 的 研 究 ？答 ： 引 入 酶 切 位 点 ， 将 PCR 产 物 克 隆 ； 引 入 噬 菌 体 启 动 子 ， 制 备 单链 探 针 。14、 什 么 是 反 向 PCR？ 应 用 于 怎 样 的 研 究 ？答 ： PCR 只 能 扩 增 两 端 序 列 已 知 的 基 因 片 段 ， 反 向 PCR 可 扩 增 中 间 一段 已 知 序 列 ， 而 两 端 序 列 未 知 的 基 因 片 段 不 扩 增 。 反 向 PCR 的 目 的在 于 扩 增 一 段 已 知 序 列 旁 侧 的 DNA， 也 就 是 说 这 一 反 应

46、 体 系 不 是 在一 对 引 物 之 间 而 是 在 引 物 外 侧 合 成 DNA。15、 什 么 是 原 位 PCR? 应 用 于 怎 样 的 研 究 ？答 ： 就 是 在 组 织 细 胞 里 进 行 PCR 反 应 ， 它 结 合 了 具 有 细 胞 定 位 能 力 的原 位 杂 交 和 高 度 特 异 敏 感 的 PCR 技 术 的 优 点 。 原 位 PCR 既 能 分 辩 鉴定 带 有 靶 序 列 的 细 胞 ， 又 能 标 出 靶 序 列 在 细 胞 内 的 位 置 ， 分 子 和 细 胞水 平 上 研 究 疾 病 的 发 病 机 理 和 临 床 过 程 及 病 理 的 转 归

47、 有 重 大 的 实 用 价值 。16、 什 么 是 RAPD？ 应 用 于 怎 样 的 研 究 ？答 ： RAPD 即 随 即 扩 增 多 态 DNA 分 析 ： 两 个 物 种 的 个 体 之 间 ， 亲 缘关 系 越 近 其 相 应 PCR 扩 增 的 带 型 就 越 相 似 ， 繁 殖 差 异 悬 殊 ， 利 用 这种 原 理 的 技 术 成 为 RAPD， 应 用 于 生 物 多 样 性 分 析 。 （ 单 个 人 工 合 成的 随 机 多 态 核 苷 酸 序 列 为 引 物 ） 。第 三 章 核 酸 分 析 与 合 成3、 末 端 终 止 法 进 行 DNA 测 序 的 原 理 。

48、答 ： DNA 链 中 核 苷 酸 以 3,5-磷 酸 二 酯 键 连 接 ， 合 成 DNA 所 用 的底 物 是 2-脱 氧 核 苷 三 磷 酸 。 2,3ddNTP 与 普 通 dNTP 不 同 ， 它们 在 脱 氧 核 糖 的 3位 置 缺 少 一 个 羟 基 。 在 DNA 聚 合 酶 作 用 下 通 过三 磷 酸 基 团 掺 入 到 延 伸 的 DNA 链 中 ， 但 由 于 没 有 3羟 基 ， 不 能 同后 续 的 dNTP 形 成 磷 酸 二 酯 键 ， 因 此 ， 正 在 延 伸 的 DNA 链 不 能 继 续延 伸 。 在 DNA 合 成 反 应 混 合 物 的 4 种

49、普 通 dNTP 中 加 入 少 量 的 一 种ddNTP， 链 延 伸 将 与 偶 然 发 生 但 却 十 分 特 异 的 链 终 止 竞 争 ， 产 物 是 一系 列 的 核 苷 酸 链 ， 其 长 度 取 决 于 引 物 末 端 到 出 现 过 早 链 终 止 位 置 间 的距 离 。 在 4 组 独 立 酶 反 应 中 分 别 采 用 4 种 不 同 的 ddNTP， 结 果 将 产 生4 组 寡 核 苷 酸 ， 它 们 将 分 别 终 止 于 模 板 链 的 A、 C、 G 或 T 位 置 。6、 核 酸 的 化 学 合 成 都 有 哪 些 方 法 ？ 现 在 常 用 的 是 哪 种 ？ 其 原 理 和 过程 是 什 么 ？答 ： （ 1） 磷 酸 二 酯 法 ： 付 产 物 多 、 产 率 低 、 操 作 复 杂(2)磷 酸 三 酯 法 :核 苷 间 的 磷 酸 基 以 三 酯 存 在 。 付 产 物 少 、 磷 酸 基 被 保护 可 用 硅 胶 柱 分 离 、 产 率 高 、 反 应 时 间 短 速 度 快(3)亚 磷 酸 三 酯 法 ： 反 应 速 度 快