1、医学基础药理学专业优秀论文 血视网膜外屏障的发育及神经视网膜分泌物对紧密连接的调节作用关键词：视网膜疾病 血视网膜外屏障 神经视网膜分泌物 紧密连接摘要：研究目的：视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜
2、外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明，若在神经视网膜未发生退化变性前移植RPE 细胞或共同移植 RPE 细胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在 RPE 细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分
3、别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是 RPE 移植提供理论基础。 研究方法：本研究利用Affymetrix 基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节，利用 STEM（Short Time-series Expression Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚
4、类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用 Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与RPE 屏障功能密切相关的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在 mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA
5、 抑制其表达观察对培养的RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 12 类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的 89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如RP
6、E65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与 RPE功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于 RPE屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 claudin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，Western Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对 claudins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提
7、供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主要表现
8、为维持其生物学特性。通过对 TJ蛋白 claudin 家族在 mRNA 及蛋白水平的研究发现，rcSF3 可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平，且对于同一个 claudin 在 mRNA 和蛋白水平可能存在不同的调节机制。正文内容研究目的：视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连
9、接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明，若在神经视网膜未发生退化变性前移植RPE 细胞或共同移植 RPE 细胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在
10、 RPE 细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是 RPE 移植提供理论基础。 研究方法：本研究利用Affymetrix 基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节，利用 STEM（Short Time-series Expressi
11、on Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用 Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与RPE 屏障功能密切相关的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在 mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功
12、能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA 抑制其表达观察对培养的RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 12 类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的
13、89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如RPE65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与 RPE功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于 RPE屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 claudin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，Western Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对 cl
14、audins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视
15、网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主要表现为维持其生物学特性。通过对 TJ蛋白 claudin 家族在 mRNA 及蛋白水平的研究发现，rcSF3 可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平，且对于同一个 claudin 在 mRNA 和蛋白水平可能存在不同的调节机制。研究目的：视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在
16、着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明，若在神经视网膜未发生退化变性前移植 RPE 细胞或共同移植 RPE 细胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明
17、神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在 RPE细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是RPE 移植提供理论基础。 研究方法：本研究利用 Affymetrix 基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节
18、，利用 STEM（Short Time-series Expression Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与 RPE 屏障功能密切相关的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布
19、变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA 抑制其表达观察对培养的 RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 12类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯
20、片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的 89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如 RPE65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与 RPE 功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于 RPE 屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 claudin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，We
21、stern Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对claudins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表
22、达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主要表现为维持其生物学特性。通过对 TJ 蛋白 claudin 家族在mRNA 及蛋白水平的研究发现，rcSF3 可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平，且对于同一个 claudin 在 mRNA 和蛋白水平可能存在不同的调节机制。研究目的：视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一
23、个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明，若在神经视网膜未发生退化变性前移植 RPE 细胞或共同移植 RPE 细胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移
24、植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在 RPE细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是RPE 移植提供理论基础。 研究方法：本研究利用 Affymetrix 基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化
25、以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节，利用 STEM（Short Time-series Expression Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与 RPE 屏障功能密切相关的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或
26、不同培养条件下它们在mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA 抑制其表达观察对培养的 RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 12类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连
27、接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的 89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如 RPE65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与 RPE 功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于 RPE 屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 cla
28、udin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，Western Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对claudins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上
29、房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主要表现为维持其生物学特性。通过对 TJ 蛋白 claudin 家族在mRNA 及蛋白水平的研究发现，rcSF3 可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平，且对于同一个 claudin 在 mRNA 和蛋白水平可能存在不同的调节机制。研究目的：视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜
30、）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明，若在神经视网膜未发生退化变性前移植 RPE 细胞或共同移植 RPE 细
31、胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在 RPE细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是RPE 移植提供理论基础。 研究方法：本研究利用 Affymetrix 基因芯片分别
32、检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节，利用 STEM（Short Time-series Expression Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与 RPE 屏障功能密切相关的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PC
33、R、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA 抑制其表达观察对培养的 RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 1
34、2类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的 89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如 RPE65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与 RPE 功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经
35、视网膜对于 RPE 屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 claudin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，Western Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对claudins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的
36、标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主要表现为维持其生物学特性。通过对 TJ 蛋白 claudin 家族在mRNA 及蛋白水平的研究发现，rcSF3 可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平，且对于同一个 claudin 在 mRNA 和蛋白水平可能存在不同的调节机制。研究目的：视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epitheli
37、um，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明
38、，若在神经视网膜未发生退化变性前移植 RPE 细胞或共同移植 RPE 细胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在 RPE细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是RPE 移植
39、提供理论基础。 研究方法：本研究利用 Affymetrix 基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节，利用 STEM（Short Time-series Expression Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与 RPE 屏障功能密切相关
40、的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA 抑制其表达观察对培养的 RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受
41、到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 12类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的 89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如 RPE65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与 RPE 功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E
42、14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于 RPE 屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 claudin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，Western Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对claudins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程
43、。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主要表现为维持其生物学特性。通过对 TJ 蛋白 claudin 家族在mRNA 及蛋白水平的研究发现，rcSF3 可使其在培养细胞中的表达更接近体内水平，且对于同一个 claudin 在 mRNA 和蛋白水平可能存在不同的调节机制。研究目的：
44、视网膜由视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）和视网膜神经感觉层（neural retina，神经视网膜）组成，RPE 细胞顶部的微绒毛与光感受器外节呈交错对插嵌合，共同组成一个统一的功能单位，对维持光感受器微环境发挥着重要的作用。另外，视网膜存在着内、外屏障，视网膜内屏障由视网膜毛细血管管壁内皮细胞之间存在的紧密连接及包裹在内皮细胞外的周细胞构成，而 RPE 细胞之间的紧密连接则构成了视网膜外屏障，防止脉络膜血管丛中的大分子物质进入到视网膜。正是由于存在着视网膜内、外屏障，神经视网膜在正常情况下始终保持干燥而透明。其中任何一种屏障发生障碍，血管中的血浆
45、等成分必会渗漏入神经感觉层内，引起视网膜水肿或脱离。 视网膜移植研究表明，若在神经视网膜未发生退化变性前移植 RPE 细胞或共同移植 RPE 细胞层和感光细胞层，RPE 细胞往往会分化良好，若感觉层已发生变性，单纯移植 RPE 细胞会使移植体发生去分化，而失去 RPE 细胞的功能。这说明神经视网膜能够诱导 RPE 的分化。目前大量关于视网膜疾病的研究均集中在 RPE细胞层对神经视网膜的影响，而后者对前者的调节作用则研究甚少。本研究分别从体内、体外两部分入手，利用基因学手段检测了 RPE 细胞在自身发育过程中的调节变化以及神经视网膜对培养的 RPE 细胞功能，尤其是屏障功能的影响。并希望从中发现
46、调节 RPE 发育的关键因素，为将来视网膜疾病的治疗，尤其是RPE 移植提供理论基础。 研究方法：本研究利用 Affymetrix 基因芯片分别检测不同日龄的鸡胚（E7，E10，E14，E18）RPE 的基因表达变化以及神经视网膜分泌物对培养的 E7，E14 RPE 细胞的基因表达的调节，利用 STEM（Short Time-series Expression Miner）软件根据基因在不同发育时期，或不同培养条件下的表达水平进行聚类分析（cluster analysis） ，并在此基础上利用Gene Ontology 分类软件和 Affymetrix 软件进行功能分类，根据基因的共表达推测某
47、些功能未知基因的生物学功能。对于我们感兴趣的与 RPE 屏障功能密切相关的基因，如 claudin 家族及 ZO 家族，我们又利用实时定量 PCR、Western Blot、免疫荧光检测等方法分别检测了不同发育时期或不同培养条件下它们在mRNA 水平、蛋白水平的表达变化以及在细胞内的分布变化。我们还将通过增加或减少靶基因的表达对每个 claudin 的功能进行研究，目前已以 claudin20 为目标做了先锋实验，通过 siRNA 抑制其表达观察对培养的 RPE 细胞屏障功能的影响。 结果：在 Affymetrix 基因芯片上的 37694 个探针组（probe sets）中，RPE 组织中检
48、测到 20495 个基因表达，其中 8889 个基因的表达在发育过程中受到调节，4814 个基因的表达变化具有显著性意义，并根据表达模式分为 12类，每一类中的基因具有相似的表达谱。通过与 22 个与紧密连接和粘附连接相关的基因的实时定量 PCR 结果对比，仅有 2 个基因的表达与基因芯片检测结果有差异。培养细胞的基因芯片检测结果显示，体内所表达基因的 89和 86分别在 E7 和 E14 中表达，均包括 RPE 标志性基因如 RPE65 和 Bestrophin。其中，在 E7 细胞中，15的基因受到视网膜神经感觉层分泌物的调节，E14 细胞中，仅约 19受到调节。通过对其中 610 个与
49、RPE 功能密切相关的基因的表达谱进一步分析发现，在培养的 E7 和 E14 细胞中，分别有 17和 62的基因受到视网膜神经感觉层的调节。神经视网膜对于 RPE 屏障功能的影响则主要体现在对紧密连接跨膜蛋白 claudin 家族成员的调节。除对该家族蛋白在 mRNA 水平的调节外，Western Blot 和免疫细胞化学显示视网膜神经感觉层分泌物可能对claudins 在蛋白水平还存在着不同的调节机制。 结论：基因芯片技术为我们所提供的对于 RPE 细胞发育及与其周围环境相互作用的动态认识已远远超出我们基于形态学检查的预期结果。细胞顶端紧密连接复合体的逐步成熟、细胞外基质相互作用以及跨细胞转运能力的逐步健全都揭示了视网膜发育过程中血视网膜屏障的逐步建立及完善过程。这些数据为我们评价 RPE 细胞培养模型成功与否提供了一个更值得信赖的标准。原代培养的胚胎 RPE 细胞的基因表达与正常组织相似，尤其在细胞上房培养基中引入正常视网膜细胞生存环境中的成分后，细胞的分化水平及基因的表达水平更接近于体内正常组织。对于不成熟的 RPE 细胞（E7） ，神经视网膜分泌物可以促进其分化；而对于已成熟的 RPE 细胞（E14） ，则主
