1、生物化学与分子生物学专业毕业论文 精品论文 克氏原螯虾两种模式识别受体基因的克隆、重组表达及功能分析关键词：模式识别受体 重组表达 基因克隆 甲壳动物 细菌侵染摘要：模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RNA 干扰技术，并利用新建立RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Proc
2、ambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及 C-型凝集素基因进行了研究。 首先，通过体外转录合成目标基因的双链 RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体，建立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarki
3、i)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69
4、)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定
5、量 PCR 技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明 PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明 PcLGBP 基因可能参与螯虾的细菌防御反应。 利用酶联免疫法对重组 PcLGBP 蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组 PcLGBP 蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的 -1，3-葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解 PcLGBP 基因在细菌防御中的作用，利用 RNA 干扰技术沉默 PcLGBP 基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP 基因沉默显著降低了克氏原螯虾对
6、革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC 基因的 cDNA 全序列包含一个 813bp 的 ORF，编码 271 个氨基酸，在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在 C 末端有一个糖识别结构域(CarbohLydrate recognition domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PcLEC 同甲壳动物、昆虫等物种的 C 型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，PcLEC 与经典的半乳糖结合 C-型凝集素具有相似的空间结构，有七个 折叠，2 个 螺旋共九个二级结构元件，有两对二
7、硫键和一个长环状结构，是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR 技术对 PcLEC 基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到 PcLEC 基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增强 PcLEC 基因的表达。对重组PcLEC 蛋白进行凝菌实验表明重组 PcLEC 对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖 Ca2+的凝集效应，这种凝集效应能够被半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了 PcLEC 对半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺具有较强的结
8、合活性。 本研究的结果表明 PcLGBP 和 PcLEC 分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和 C 型凝集素家族的两个模式识别受体。PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，PcLEC 基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达，在血细胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP 蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及 -1，3-葡聚糖结合，介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC 蛋白能够与半乳糖及其衍生物 N-乙酰半乳糖胺结合，以钙离子依赖的方式凝集细菌。正文内容模式识别受体(Pattern recognition receptor，
9、PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RNA 干扰技术，并利用新建立RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及 C-型凝集素基因进行了研究。 首先，通过体外转录合成目标基因的双链 RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenae
10、us vannamei)个体，建立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open rea
11、ding frame，ORF)，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding
12、protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量 PCR 技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明 PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明 PcLGBP 基因可能参与螯虾的细菌防御反应。 利用酶联免疫法对重组 PcLGBP 蛋白与细菌和真菌表面
13、多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组 PcLGBP 蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的 -1，3-葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解 PcLGBP 基因在细菌防御中的作用，利用 RNA 干扰技术沉默 PcLGBP 基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP 基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC 基因的 cDNA 全序列包含一个 813bp 的 ORF，编码 271 个氨基酸，在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在 C
14、末端有一个糖识别结构域(CarbohLydrate recognition domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PcLEC 同甲壳动物、昆虫等物种的 C 型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，PcLEC 与经典的半乳糖结合 C-型凝集素具有相似的空间结构，有七个 折叠，2 个 螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR 技术对 PcLEC 基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到 PcLEC 基因的表达，其中在血细胞和肝胰
15、腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增强 PcLEC 基因的表达。对重组PcLEC 蛋白进行凝菌实验表明重组 PcLEC 对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖 Ca2+的凝集效应，这种凝集效应能够被半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了 PcLEC 对半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺具有较强的结合活性。 本研究的结果表明 PcLGBP 和 PcLEC 分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和 C 型凝集素家族的两个模式识别受体。PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，PcLEC 基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达，在血细
16、胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP 蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及 -1，3-葡聚糖结合，介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC 蛋白能够与半乳糖及其衍生物 N-乙酰半乳糖胺结合，以钙离子依赖的方式凝集细菌。模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RN
17、A 干扰技术，并利用新建立 RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及C-型凝集素基因进行了研究。 首先，通过体外转录合成目标基因的双链RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体，建立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用 RACE(Ra
18、pid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-
19、Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶
20、的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量 PCR 技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明 PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明 PcLGBP 基因可能参与螯虾的细菌防御反应。 利用酶联免疫法对重组 PcLGBP 蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组 PcLGBP 蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的 -1，3-葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解 PcLGBP 基因在细菌防御中的作用，利用 RNA 干扰技术
21、沉默 PcLGBP 基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP 基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC 基因的 cDNA 全序列包含一个 813bp 的 ORF，编码 271 个氨基酸，在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在 C 末端有一个糖识别结构域(CarbohLydrate recognition domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PcLEC 同甲壳动物、昆虫等物种的 C 型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，P
22、cLEC 与经典的半乳糖结合 C-型凝集素具有相似的空间结构，有七个 折叠，2 个 螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR 技术对 PcLEC 基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到 PcLEC 基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增强 PcLEC 基因的表达。对重组PcLEC 蛋白进行凝菌实验表明重组 PcLEC 对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖 Ca2+的凝集效应，这种凝集效应
23、能够被半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了 PcLEC 对半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺具有较强的结合活性。 本研究的结果表明 PcLGBP 和 PcLEC 分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和 C 型凝集素家族的两个模式识别受体。PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，PcLEC 基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达，在血细胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP 蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及 -1，3-葡聚糖结合，介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC 蛋白能够与半乳糖及其衍生物 N-乙酰半乳糖
24、胺结合，以钙离子依赖的方式凝集细菌。模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RNA 干扰技术，并利用新建立 RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及C-型凝集素基因进行了研究。 首
25、先，通过体外转录合成目标基因的双链RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体，建立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为
26、 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖
27、结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量 PCR 技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明 PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说
28、明 PcLGBP 基因可能参与螯虾的细菌防御反应。 利用酶联免疫法对重组 PcLGBP 蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组 PcLGBP 蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的 -1，3-葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解 PcLGBP 基因在细菌防御中的作用，利用 RNA 干扰技术沉默 PcLGBP 基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP 基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC 基因的 cDNA 全序列包含一个 813bp 的 O
29、RF，编码 271 个氨基酸，在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在 C 末端有一个糖识别结构域(CarbohLydrate recognition domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PcLEC 同甲壳动物、昆虫等物种的 C 型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，PcLEC 与经典的半乳糖结合 C-型凝集素具有相似的空间结构，有七个 折叠，2 个 螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR 技术对 PcLEC 基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行
30、了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到 PcLEC 基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增强 PcLEC 基因的表达。对重组PcLEC 蛋白进行凝菌实验表明重组 PcLEC 对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖 Ca2+的凝集效应，这种凝集效应能够被半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了 PcLEC 对半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺具有较强的结合活性。 本研究的结果表明 PcLGBP 和 PcLEC 分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和 C 型凝集素家族的两个模式识别受体。Pc
31、LGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，PcLEC 基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达，在血细胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP 蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及 -1，3-葡聚糖结合，介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC 蛋白能够与半乳糖及其衍生物 N-乙酰半乳糖胺结合，以钙离子依赖的方式凝集细菌。模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmole
32、cular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RNA 干扰技术，并利用新建立 RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及C-型凝集素基因进行了研究。 首先，通过体外转录合成目标基因的双链RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体，建立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性
33、的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋
34、白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫
35、的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量 PCR 技术分析了其对细菌刺激的响应，结果表明 PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明 PcLGBP 基因可能参与螯虾的细菌防御反应。 利用酶联免疫法对重组 PcLGBP 蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组 PcLGBP 蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的 -1，3-葡聚糖结合，而对来源于革兰
36、氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解 PcLGBP 基因在细菌防御中的作用，利用 RNA 干扰技术沉默 PcLGBP 基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP 基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC 基因的 cDNA 全序列包含一个 813bp 的 ORF，编码 271 个氨基酸，在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在 C 末端有一个糖识别结构域(CarbohLydrate recognition domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成
37、两对链内二硫键。PcLEC 同甲壳动物、昆虫等物种的 C 型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，PcLEC 与经典的半乳糖结合 C-型凝集素具有相似的空间结构，有七个 折叠，2 个 螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR 技术对 PcLEC 基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到 PcLEC 基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增强 PcLEC 基因的表达。对重组PcLEC 蛋白进
38、行凝菌实验表明重组 PcLEC 对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖 Ca2+的凝集效应，这种凝集效应能够被半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了 PcLEC 对半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺具有较强的结合活性。 本研究的结果表明 PcLGBP 和 PcLEC 分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和 C 型凝集素家族的两个模式识别受体。PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，PcLEC 基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达，在血细胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP 蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及 -1，3
39、-葡聚糖结合，介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC 蛋白能够与半乳糖及其衍生物 N-乙酰半乳糖胺结合，以钙离子依赖的方式凝集细菌。模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因编码的一类参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RNA 干扰技术，并利用新建立 RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus cl
40、arkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及C-型凝集素基因进行了研究。 首先，通过体外转录合成目标基因的双链RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体，建立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个
41、模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69)。在其类葡聚糖酶结构
42、域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量 PCR 技术分析了
43、其对细菌刺激的响应，结果表明 PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，能响应热致死鳗弧菌刺激而增强表达，说明 PcLGBP 基因可能参与螯虾的细菌防御反应。 利用酶联免疫法对重组 PcLGBP 蛋白与细菌和真菌表面多糖的结合活性进行了鉴定，表明重组 PcLGBP 蛋白能与来源于革兰氏阴性细菌的脂多糖和来源于真菌的 -1，3-葡聚糖结合，而对来源于革兰氏阳性细菌的肽聚糖则没有结合活性。为进一步了解 PcLGBP 基因在细菌防御中的作用，利用 RNA 干扰技术沉默 PcLGBP 基因的表达，并用三种不同的病原菌进行了细菌侵染实验。PcLGBP 基因沉默显著降低了克氏原螯虾对革兰氏阴性细菌的防御能
44、力，而对革兰氏阳性细菌侵染没有显著的影响。 PcLEC 基因的 cDNA 全序列包含一个 813bp 的 ORF，编码 271 个氨基酸，在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，以及一段富含甘基酸的序列，在 C 末端有一个糖识别结构域(CarbohLydrate recognition domain，CRD)。另外还有四个半胱氨酸残基，可能参与形成两对链内二硫键。PcLEC 同甲壳动物、昆虫等物种的 C 型凝集素都有明显的序列相似性。空间结构预测表明，PcLEC 与经典的半乳糖结合 C-型凝集素具有相似的空间结构，有七个 折叠，2 个 螺旋共九个二级结构元件，有两对二硫键和一个长环状结构，
45、是一个经典的短型凝集素。利用实时定量PCR 技术对 PcLEC 基因的组织表达和细菌刺激后的时序表达变化进行了检测。在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞等六个组织中均检测到 PcLEC 基因的表达，其中在血细胞和肝胰腺中的表达量最高，而在肌肉、鳃和性腺中的表达量相对较低。同时，热致死的细菌注射能显著增强 PcLEC 基因的表达。对重组PcLEC 蛋白进行凝菌实验表明重组 PcLEC 对大肠杆菌、鳗弧菌和藤黄微球菌都表现出依赖 Ca2+的凝集效应，这种凝集效应能够被半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺抑制。酶联免疫实验进一步证实了 PcLEC 对半乳糖和 N-乙酰半乳糖胺具有较强的结合活性。 本研究的结果
46、表明 PcLGBP 和 PcLEC 分别为革兰氏阴性细菌结合蛋白和 C 型凝集素家族的两个模式识别受体。PcLGBP 基因是肝胰腺特异表达的基因，PcLEC 基因在肌肉、心、肝胰腺、鳃、性腺和血细胞中均能表达，在血细胞和肝胰腺中表达量最高。二者均能够被热致死的鳗弧菌刺激表达上调。PcLGBP 蛋白能够与革兰氏阴性细菌和真菌的表面多糖脂多糖以及 -1，3-葡聚糖结合，介导克氏原螯虾革兰氏阴性细菌侵染的防御。PcLEC 蛋白能够与半乳糖及其衍生物 N-乙酰半乳糖胺结合，以钙离子依赖的方式凝集细菌。模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRR)是由胚系基因编码的一类
47、参与病原识别的蛋白质，它们能够与微生物表面病原相关的分子模式(Pathogen associatedmolecular pattern，PAMP)相互作用而激活宿主的先天性免疫系统。本研究首先在甲壳动物中建立了 RNA 干扰技术，并利用新建立 RNA 干扰技术结合基因原核重组、荧光定量 PCR 等分子生物学技术对克氏原螯虾(Procambarus clarkii)的两个模式识别受体基因脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因以及C-型凝集素基因进行了研究。 首先，通过体外转录合成目标基因的双链RaNA，将双链 RNA 注射克氏原螯虾或凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)个体，建
48、立了稳定 RNA 干扰技术，能够有效沉默目标基因的表达。而且，这种 RNA 干扰介导的基因沉默效应能够系统性的发生，至少持续 96 小时，能够满足本研究中对模式识别受体基因功能鉴定的要求。 随后，利用 RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)技术从克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中克隆、鉴定了两个模式识别受体基因：脂多糖和 -1，3-葡聚糖结合蛋白基因(命名为 PcLGBP)和 C-型凝集素基因(命名为 PcLEC)。 PcLGBP 基因 cDNA 全序列包含一个 1107bp 的开放阅读框(Open reading frame，ORF)
49、，编码 369 个氨基酸。在 N 末端有一个 17 个氨基酸的信号肽，表明 PcLGBP 是一个分泌的胞外蛋白。PcLGBP 蛋白的氨基酸序列中包含一个糖基水解酶结构域和一个 -1，3-糖苷键识别序列(Phe235-Asp253)以及两个细胞粘附位点(RGD106-108，157-159)和一个 N 糖基化位点(NRSI66-69)。在其类葡聚糖酶结构域还包含决定葡聚糖酶活性的保守氨基酸。同源性分析发现 PcLGBP 与甲壳类动物的脂多糖和 -1，3 葡聚糖结合蛋白 LGBP(Lipopolysaccharide and p-1，3-glucan binding protein，LGBP)或 -1，3 葡聚糖结合蛋白(-1，3-glucan binding protein，BGBP)同源，与一些昆虫的革兰氏阴性细菌结合蛋白(Gram-negative bacteria protein，GNBP)及葡聚糖酶的一致性高于 40。为分析PcLGBP 基因的功能，通过半定量 RT-PCR 方法研究了其在组织中的分布，并用荧光定量
