人纤溶酶原k5抑制胃癌生长及机制研究.doc

1、药物化学专业优秀论文 人纤溶酶原 K5 抑制胃癌生长及机制研究关键词：人纤溶酶原 胃癌 生物治疗 内皮细胞 核转录因子摘要：人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由

2、于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的 VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成

3、；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化 K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a

4、 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Wester

5、nblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调

6、HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌

7、的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。正文内容人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K

8、5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞

9、与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤

10、生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示

11、纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernb

12、lot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转

13、位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的

14、治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构

15、和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研

16、究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像

17、系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调

18、作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生

19、血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有

20、抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌

21、。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，

22、尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His

23、 Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K

24、5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在S

25、GC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringle

26、s15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（

27、VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 H

28、IF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋

29、白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901

30、）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工

31、程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片

32、段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导

33、缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制

34、 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 B

35、L21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量

36、为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并

37、呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候选药物。人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（

38、kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血

39、管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以

40、往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5

41、表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖

42、的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在

43、低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HIF1a 和抑制其核转位来降低 VEGF 的表达。在 SGC7901 胃癌细胞肿瘤上，肿瘤细胞分泌的 VEGF 通过旁分泌作用于肿瘤血管内皮细胞，影响肿瘤血管增生从而抑制肿瘤生长。该研究拓宽了 K5 的治疗范围，不仅可用于血管增生性疾病的治疗，同时也是胃癌等恶性肿瘤治疗的新的有效候

44、选药物。人纤溶酶原（plasminogen）含有 5 个环状结构域（kringles） ，水解后可产生一组具有抑制血管增生作用的小分子片段：Angiostatin（kringles14） ，kringles15，kringles13 和 kringles5（K5） ，具有抑制内皮细胞增生的作用。血管抑素（Angiostatin）用于肿瘤的治疗已进入临床期试验阶段。较之血管抑素（分子量约 45KDa） ，K5 具有分子量小（16KDa） 、性质稳定且活性更强的优点。 在肿瘤组织中由于肿瘤细胞快速生长，造成局部微环境相对缺氧。HIF1a 是细胞在低氧状态下被活化的最重要的核转录因子和细胞内氧适应调

45、节因子，它能和靶基因启动子中缺氧反应元件（HRE）结合调控靶基因如血管内皮生长因子（VEGF） 、红细胞生成素（EPO）等的表达，在介导缺氧微环境促进恶性实体瘤生长和转移中起关键作用。 血管内皮生长因子（VEGF）是一种很强的血管增生刺激因子，几乎所有的实体瘤细胞都能分泌。肿瘤细胞分泌的VEGF 可诱导或调控肿瘤的血管形成及新生血管的结构和功能异常，从而支持肿瘤生长。一方面以旁分泌的方式作用于血管内皮细胞与血管内皮细胞上的受体结合，引发一系列信号转导，刺激内皮细胞分化和血管生成；另一方面，以自分泌的方式与肿瘤细胞上的 Flt1 或 KDR 受体结合可刺激肿瘤细胞的增殖与迁移。目前对 K5 的研

46、究大多数集中在其对内皮细胞的作用，而对肿瘤细胞直接作用的研究甚少。以往研究证实在微血管内皮细胞 K5 能通过下调核内 HIF1a 而抑制 VEGF 表达，具体机制未见深入研究。K5 能否通过对肿瘤细胞 HIF1a 信号调控途径的抑制而在肿瘤生长的防治中发挥潜在的抗瘤活性，尚未有系统研究。 综上所述，本课题拟从 K5 抑制胃癌生长进行深入研究：（1）表达纯化K5（2）在细胞水平和肿瘤模型上证明 K5 对肿瘤生长的抑制作用。 （3）以SGC7901 胃癌细胞为研究对象，从 HIF1a 调控 VEGF 细胞信号通路为切入点，探索 K5 对核转录因子 HIF1a 及 VEGF 的作用，揭示 K5 抑制

47、肿瘤生长的分子机制。 主要研究内容和结果如下： 第 1 部分 K5 表达及纯化 1获得高纯度可溶性的重组蛋白。鉴定正确的重组体转化到 BL21（DE3）宿主菌中，经IPTG 低温诱导，可表达出可溶性重组蛋白。诱导表达的细菌经溶菌酶充分消化后，离心取上清，用 Ni2+His Bind Resin 亲和柱纯化，获得高纯度可溶性蛋白。用凝胶成像系统（GENE GENIUS 公司产品）对凝胶进行灰度扫描，结果显示纯化后重组蛋白纯度可达：K5 约为 926%，纯化的重组蛋白经 Westernblot 分析显有明显的免疫杂交带。 第 2 部分 K5 蛋白抑制胃癌生长的体内外研究 1K5 对培养的 SGC7

48、901 细胞增殖的影响。K5 无明显地抑制 SGC7901 细胞增殖的作用。 2 K5 抑制胃癌裸鼠肿瘤生长的效应。腹腔注射 K5总剂量为 125mg/kg 时，对 BALB/c 裸鼠胃癌（SGC7901）实体瘤生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为 67%。 第 3 部分 K5 抑制胃癌生长的分子机制初步探讨 1K5 对 HIF1a 具有下调作用，并抑制其核转位。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot 分析，结果显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞具有下调 HIF1a 并抑制其核转位，而在常氧下无明显的作用。 2 K5 下调SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达。通过 SP 免疫细胞化学法和 Westernblot分析，显示 K5 在低氧下对 SGC7901 胃癌细胞 VEGF 的表达具有下调作用，并呈剂量依赖性；在常氧下变化不明显。 结论及研究意义: 1获得其基因工程纯化蛋白。 2首次发现 K5 具有抑制胃癌生长的作用。 3首次在SGC7901 胃癌细胞异种种植裸鼠模型上，阐述了 K5 抑制肿瘤新生血管从而抑制肿瘤生长的机制：K5 通过下调 HI