1、临床检验诊断学专业毕业论文 精品论文 乙型脑炎病毒 NS1 基因原核表达及脑炎抗体检测方法的初步研究关键词：乙型脑炎病毒 NS1 基因 原核表达 脑炎抗体检测 ELISA 法摘要：目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在Ecoil 中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，
2、利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌
3、 BL21(DE3)，用 IPTG诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.
4、0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结
5、果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。正文内容目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在Ecoil 中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法
6、，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受
7、态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 EL
8、ISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为8
9、9.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，
10、通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段
11、，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的
12、蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD
13、 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，
14、并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体
15、PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-P
16、AGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-N
17、S1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-N
18、S1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒
19、接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提
20、重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (
21、1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原
22、建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的
23、方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-2
24、8a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表
25、达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全
26、菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构
27、建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用
28、BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目
29、的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(
30、DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提
31、供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因
32、，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索
33、最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 130
34、0bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度
35、。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙
36、型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经
37、初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接
38、ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证
39、实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋
40、白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得
41、 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯
42、度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示
43、，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血
44、清进行临床验证。目的：克隆乙型脑炎病毒 NS1 基因，构建 NS1 基因原核表达载体并在 Ecoil中进行表达，通过 Ni-NTA 柱纯化重组蛋白，并将纯化的重组蛋白作为包被抗原，建立检测血清乙型脑炎病毒 IgG 抗体的方法，为乙型脑炎病毒快速检测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒理论研究提供基础。 方法： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因的克隆及序列测定：将乙型脑炎病毒接种 Vero 细胞，待细胞病变明显后，收集细胞悬液，利用 RT-PCR 技术扩增乙型脑炎病毒 NS1 基因，用胶回收试剂盒回收目的片段，将回收产物与克隆测序载体 PGEM-T 载体连接后进行测序。 (2)原核表达载
45、体的构建及鉴定：扩增产物和质粒 pET-28a(+)用 BamH和 Hind双酶切后，用胶回收试剂盒回收目的片段，将载体和目的插入片段用 T4 连接酶进行连接，获得 pET-28a(+)-NS1 重组质粒。将 pET-28a(+)-NS1 重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，抽提质粒进行双酶切鉴定和 PCR 初步鉴定，经初步鉴定后进行测序鉴定。 (3)重组质粒的诱导表达：抽提重组质粒 pET-28a(+)-NS1 后转化表达宿主菌 BL21(DE3)，用 IPTG 诱导表达，并摸索最佳表达条件，用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步观察重组蛋白 NS1 的表达量并对其进行
46、初步的分析。 (4)表达蛋白的纯化及抗原性分析：将含有目的基因的宿主菌接种液体培养基进行增菌并大量表达，表达后的蛋白通过 Ni-NTA 柱进行免疫亲和层析，获得高纯度的表达蛋白。并用Western-bloting 检测表达蛋白的抗原性。 (5)病毒 NS1 蛋白快速检测 ELISA法的建立：将纯化抗原包被聚丙乙烯板，建立间接 ELISA 方法检测抗 JEV-NS1抗体。 结果： (1)乙型脑炎病毒 NS1 基因 PCR 扩增产物进行 1.0琼脂糖凝胶电泳，产物为单一条带，大小约为 1300bp。用特异性引物对重组质粒 pET-28a(+)-NS1 进行序列测定，测定结果与文献报道的 NS1 基
47、因序列一致。 (2)用重组质粒转化宿主表达菌 BL21(DE3)后，用 IPTG 诱导表达出 Mr 为 46KD 左右的重组蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，IPTG 诱导 4h 重组蛋白的表达量最高，表达量占全菌蛋白质的 33，经 Ni-NTA 柱纯化，获得纯度为89.3的重组蛋白，Western-bloting 证实表达蛋白具有良好的抗原性。 (3)以纯化蛋白为包被抗原建立了检测血清抗 NS1 抗体的间接 ELISA 方法，结果显示，在抗原稀释度为 1：10 时为最佳工作浓度。 结论：成功地构建原核表达载体pET-28a(+)-NS1，并获得重组 NS1 蛋白，为乙型脑炎病毒快速检
48、测及流行病学筛查提供方法，同时也为乙型脑炎病毒基础研究提供基础。将重组蛋白作为检测抗原制备抗体检测 ELISA，并进行了实验条件优化，下一步的工作需要收集部分患者血清进行临床验证。特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌?U 閩 AZ箾 FTP 鈦X 飼?狛P? 燚?琯嫼 b?袍*甒?颙嫯?4)=r 宵?i?j 彺帖 B3 锝檡骹笪 yLrQ#?0 鯖 l 壛枒l 壛
49、枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛渓?擗#?“?# 綫 G 刿#K 芿$?7. 耟?Wa 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 皗 E|?pDb 癳$Fb 癳$Fb癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$F?責鯻 0 橔 C,f 薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵秾腵薍秾腵%?秾腵薍秾腵薍
