1、外科学专业优秀论文 shRNA 抑制 MDR1 的表达对人脑胶质瘤干细胞多药耐药性的实验研究关键词：脑胶质瘤 多药耐药性 干细胞 药物敏感性摘要：目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 s
2、hRNA 表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7 天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价 shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 M
3、DR1 mRNA相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为 78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，3
4、9.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。正文内容目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计
5、shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA 表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第1，3，5，7 天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实
6、验，评价 shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78
7、.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(
8、MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体
9、法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM
10、shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(
11、Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSile
12、ncer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。
13、 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，
14、5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据
15、 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因
16、的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1
17、 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一
18、种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1
19、 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;
20、0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50g
21、t;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成
22、shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。
23、2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)
24、的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的
25、基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting
26、在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.
27、05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱
28、导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分
29、为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照
30、组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA
31、的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LO
32、OP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切
33、，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shR
34、NA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1 基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。目的：构建多药耐药基因(MDR1)的短发卡 RNA(short hairpin RNA shRNA)表达质粒，并检测其对胶质瘤干
35、细胞药物敏感性的影响作用，为胶质瘤的基因治疗提供实验依据。 方法 1根据 MDR1 的 DNA 序列设计 shRNA，3端加入终止信号 TTTTTT，两端分别加入 BamH 和 Hind 的酶切位点，并加入 LOOP 环(UUCAAGAGA)形成 shRNA 结构，克隆入 pSilencer3.1-H1 neo 质粒，建立 shRNA表达质粒系统，酶切，测序鉴定正确后扩增质粒。 2胶质瘤干细胞培养传代。 3实验细胞随机分为空白对照，阴性质粒对照组，MDR1 组，Siport xp-1 脂质体法转染胶质瘤干细胞，检测时间点分别选为转染后第 1，3，5，7天。 4逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)
36、，Western Blotting 在 mRNA 和蛋白水平检测目的基因的表达。 5对转染后的细胞进行药敏实验，评价shRNA 对多药耐药性的逆转作用。 结果 1成功构建 MDR1 的 shRNA 表达质粒，酶切，测序分析克隆成功，序列完全正确。 2转染后的胶质瘤干细胞成指数倍增长。 3.转染实验组 RT-PCR 定量 MDR1 mRNA 相对表达水平有所下降。100 nMshRNA 治疗组(49.34.8)，与阴性对照组(98.79.8)相比，(Plt;0.05)差异显著；其与 50nM shRNA 治疗组(78.15.9)相比，(Plt;0.05)，差异显著。实验组目的基因 mRNA 在第
37、 3 天后表达明显降低(Plt;0.05)，RT-PCR 显示 MDR1 抑制率第 3，5，7 天分别为78.4614.17，82.0211.87，79.5113.27。 4.Westem blot 显示，shRNA 转染组 P-糖蛋白(P-gp)的表达降低。显示 MDR1 第 3，5，7 天抑制率分别为 58.16.5，39.55.2，45.88.6 。 5.药敏实验显示，阿霉素、长春新碱对转染 MDR1 shRNA 的胶质瘤干细胞的，IClt;,50gt;均有不同程度降低，且出现凋亡峰(Plt;0.05)。 结论：MDR1 小干扰 RNA 可以在转录后水平对多药耐药进行调节，使 MDR1
38、基因表达下调，提高对药物的敏感性，诱导细胞凋亡，为胶质瘤基因治疗提供了一种新的手段。特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c#x 刔 彟 2Z 皙笜?D 剧珞 H 鏋 Kx 時 k,褝仆? 稀?i 攸闥-) 荮vJ 釔絓|?殢 D 蘰厣?籶(柶胊?07 姻Rl
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