1、肿瘤学专业优秀论文 HER2 与乳腺癌临床-病理关系的前瞻性分析及其 miRNAs 调控研究关键词：乳腺癌 HER2 基因 基因表达 miRNAs 分子靶向治疗摘要：背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在细胞，生长过程中扮演者重要角色的两大类基因。而原癌基因 HER2 的扩增是与乳腺癌相关的基因表达中最常见的改变。HER2 基因位于 17 号染色体，编码一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体。在乳腺浸润性导管癌中 HER2 基因扩增或蛋白过表达的发生率约为 2030。有研究表明 HER2 基因扩增或蛋白过表达不仅是重要的与乳腺癌不良预后相关生物学标记，而且是对乳腺癌化疗及内分泌治疗反应具有指
2、导作用的生物学标记，虽然关于 HER2 能否作为确实可行的预后指标尚有不同的观点，然而对 HER2 表达状态的检测已成为最佳化乳腺癌治疗方案的重要步骤。免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)已成为检测 HER2 表达状态的两种最常用的方法。而且均被国内和国际的治疗指南所推崇但究竟谁是检测 HER2 表达状态最佳的方法？是 IHC 的蛋白检测法？还是 FISH 的基因检测法？ 因此，本课题的目的之一是在当地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者关于 HER2 状态检测的FISH 和 IHC 两种方法的相关性以及乳腺癌 HER2 基因表达与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为关于 HER2 基
3、因在乳癌患者中表达比例的流行病学资料提供一些数据，为临床推广建立 FISH 检测奠定一定的基础。 在浸润性乳腺癌病例中常常伴随着 17 号染色体拷贝数的异常改变，其拷贝数可通过常规的遗传学方法和 FISH 检测来判断。而这种改变常常影响到 HER2 基因的扩增和蛋白的表达。Watters 和他的同事发现 17 号染色体拷贝数的异常改变与组织分级 III 和 ER 阴性的的病例相关，但对生存期无明显影响；另有研究提示 17 号染色体拷贝数的异常改变与乳腺癌不良预后因素相关。 因此，本课题的目的之二是当地的人群中研究乳腺癌患者 17 号染色体非整体性的发生率；分析 17号染色体倍体性与 HER2
4、基因表达及 HER2 蛋白表达的相关性。以及 17 号染色体拷贝数与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为探讨 17 号染色体倍体性这一遗传特征与乳腺癌生物学行为及预后的关系提供依据，进而为综合评估乳腺癌预后提供参考指标。 MicroRNA 简称 miRNAs 是生物体内固有的单链、非蛋白编码的长约 22 nt 的小分子 RNA，它们主要通过与靶 mRNA 的结合以转录后的方式调控着基因表达，成熟 miRNAs 通过其 5第 2-8 个核苷酸(种子序列)与它们的靶 mRNAs 的 3-UTR 内的互补位点结合而识别其靶 mRNAs，通过使其靶 mRNAs 的翻译抑制或降解来抑制基因表达，它
5、们己成为基因表达的重要调节因子。功能学研究表明 miRNAs 参与调控着细胞的增殖、分化和死亡。有研究提示，在肿瘤细胞中 miRNAs 存在着异常的表达或突变，这表明 miRNAs 可能成为一类新的原癌基因或抑癌基因。鉴于 miRNAs 在肿瘤疾病发生发展的作用，通过干预肿瘤细胞内 miRNAs 的水平来进行肿瘤的治疗的策略逐渐形成。就与 HER2基因相关的 miRNAs 而言，有研究提示在小叶癌和导管癌 HER2 阳性和 HER2 阴性标本的对比中并未发现有 miRNAs 的异常改变，另一近期的研究表明在 193 例原发的乳腺癌组织中 miRNAs 表达谱的测定中未发现特异性的 miRNAs
6、 与肿瘤分期、血管浸润、Her2 表达相关。因此作用于 HER2 基因的天然 miRNAs 目前并未有确切的研究结果。在本文中，我们应用生物信息学的方法选定两个不同保守性的与 HER23-UTR 有互补结合位点的 miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，随之应用ThepMIR_REPORTTM miRNAs 表达报告载体进行验证，即当特定的 miRNAs 与重组载体上的目标 mRNA 结合时，能阻断其蛋白的表达，进而降低其荧光素酶的活性。因此本课题的目的之三是初步研究 miR-559 和 miR-548d-3p 在参与调控HER2 基因表达方面的作用，为 HER2 基因分子靶向
7、治疗提供一定的基础数据。 研究方法： 1.应用免疫组织化学法(IHC)分别检测 52 例人乳腺癌组织中HER2 蛋白、ER 蛋白、PR 蛋白的表达。应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测 52例人乳腺癌组织中 HER2 基因的表达，以及 17 号染色体的表达。 2.收集乳腺癌病例的临床资料：绝经年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、术后分期等。 3.应用统计学方法分析 HER2 基因与 HER2 蛋白、预后因素、激素受体表达的关系；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因、HER2 蛋白，预后因素、激素受体表达的关系。 4.用生物信息学的方法预测与 HER23-UTR 有互补结合位点的miRNAs
8、并计算其自由能(G):本课题中通过生物信息学的方法，选取 miR-559和 m1R-548d-3p 作为我们的目的 miRNAs。采用 mFold Software 分析 HER23-UTR 与 miR-559、miR-548-3p 互补结合位点 5端与 3端各 70 个核苷酸序列的自由能，从而预测此位点的可接近性。 5.重组质粒的构建：将 618bp 的HER23-UTR 的基因序列；611bp 的缺失了 miR-559 种子位点(TTACTTT)的HER23#39;-UTR 基因序列；611bp 的缺失了 miR-548-3p 种子位点(GTTTTTA)的HER23#39;-UTR 基因序
9、列亚克隆到 pMIR-Luc 载体中荧光素酶基因开放阅读框的下游，并通过测序来验证其方向性和正确性。 6.转染和荧光素酶活性的检测：上述不同的重组载体与 -gal 对照载体，以及相应浓度的不同的miRNAs 前体一同转染入 Hela 细胞，不同的 miRNAs 前体包括阴性对照前体、m1R-559 前体、miR-548d-3p 或 m1R-559 加上-548d-3p 前体；转染后 48 小时检测荧光素酶活性。 研究结论： 1.52 例患者中 HER2 基因过表达的比例为38。 2.HER 蛋白 IHC 检测和 HER2 基因 FISH 法总体上具有明显的相关性，但在 IHC2+的情况存在结果
10、不一致的现象，而对于 IHC2+的患者应进一步作FISH 检测以明确诊断。 3.HER2 扩增与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 4.52 例样本中乳腺癌非整体性的比例约为 44。 5.17 号染色体的表达水平分别与 HER2 基因及蛋白表达水平呈正相关。 6.17 号染色体的表达水平的增高与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 7.miR-548d-3p 和 miR-559 两个miRNAs 均能分别与 HER2 基因的 mRNA 的 3#39;-UTR 起到特异性的识别和结合作用，进而翻译抑制重组载体荧光素酶蛋白的表达，降低荧光素酶的活性，且其效力与转染的 miRNAs 前体的浓度呈正相关。而 m
11、iR-548d-3p 和 miR-559 两个 miRNAs 联合共转染后明显地表现出高于其中一个单独转染的协同地翻译抑制作用。由此初步证实 miR-548d-3p 和 miR-559 参与 HER2 基因的调控，为进一步研究探索抑制或阻断 HER2 基因表达的分子靶向治疗提供理论和实践的数据。正文内容背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在细胞，生长过程中扮演者重要角色的两大类基因。而原癌基因 HER2 的扩增是与乳腺癌相关的基因表达中最常见的改变。HER2 基因位于 17 号染色体，编码一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体。在乳腺浸润性导管癌中 HER2 基因扩增或蛋白过表达的发生率约为
12、 2030。有研究表明 HER2 基因扩增或蛋白过表达不仅是重要的与乳腺癌不良预后相关生物学标记，而且是对乳腺癌化疗及内分泌治疗反应具有指导作用的生物学标记，虽然关于 HER2 能否作为确实可行的预后指标尚有不同的观点，然而对 HER2 表达状态的检测已成为最佳化乳腺癌治疗方案的重要步骤。免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)已成为检测 HER2 表达状态的两种最常用的方法。而且均被国内和国际的治疗指南所推崇但究竟谁是检测 HER2 表达状态最佳的方法？是 IHC 的蛋白检测法？还是 FISH 的基因检测法？ 因此，本课题的目的之一是在当地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者关于 HER2 状
13、态检测的FISH 和 IHC 两种方法的相关性以及乳腺癌 HER2 基因表达与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为关于 HER2 基因在乳癌患者中表达比例的流行病学资料提供一些数据，为临床推广建立 FISH 检测奠定一定的基础。 在浸润性乳腺癌病例中常常伴随着 17 号染色体拷贝数的异常改变，其拷贝数可通过常规的遗传学方法和 FISH 检测来判断。而这种改变常常影响到 HER2 基因的扩增和蛋白的表达。Watters 和他的同事发现 17 号染色体拷贝数的异常改变与组织分级 III 和 ER 阴性的的病例相关，但对生存期无明显影响；另有研究提示 17 号染色体拷贝数的异常改变与乳腺癌不良
14、预后因素相关。 因此，本课题的目的之二是当地的人群中研究乳腺癌患者 17 号染色体非整体性的发生率；分析 17号染色体倍体性与 HER2 基因表达及 HER2 蛋白表达的相关性。以及 17 号染色体拷贝数与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为探讨 17 号染色体倍体性这一遗传特征与乳腺癌生物学行为及预后的关系提供依据，进而为综合评估乳腺癌预后提供参考指标。 MicroRNA 简称 miRNAs 是生物体内固有的单链、非蛋白编码的长约 22 nt 的小分子 RNA，它们主要通过与靶 mRNA 的结合以转录后的方式调控着基因表达，成熟 miRNAs 通过其 5第 2-8 个核苷酸(种子序列)
15、与它们的靶 mRNAs 的 3-UTR 内的互补位点结合而识别其靶 mRNAs，通过使其靶 mRNAs 的翻译抑制或降解来抑制基因表达，它们己成为基因表达的重要调节因子。功能学研究表明 miRNAs 参与调控着细胞的增殖、分化和死亡。有研究提示，在肿瘤细胞中 miRNAs 存在着异常的表达或突变，这表明 miRNAs 可能成为一类新的原癌基因或抑癌基因。鉴于 miRNAs 在肿瘤疾病发生发展的作用，通过干预肿瘤细胞内 miRNAs 的水平来进行肿瘤的治疗的策略逐渐形成。就与 HER2基因相关的 miRNAs 而言，有研究提示在小叶癌和导管癌 HER2 阳性和 HER2 阴性标本的对比中并未发现
16、有 miRNAs 的异常改变，另一近期的研究表明在 193 例原发的乳腺癌组织中 miRNAs 表达谱的测定中未发现特异性的 miRNAs 与肿瘤分期、血管浸润、Her2 表达相关。因此作用于 HER2 基因的天然 miRNAs 目前并未有确切的研究结果。在本文中，我们应用生物信息学的方法选定两个不同保守性的与 HER23-UTR 有互补结合位点的 miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，随之应用ThepMIR_REPORTTM miRNAs 表达报告载体进行验证，即当特定的 miRNAs 与重组载体上的目标 mRNA 结合时，能阻断其蛋白的表达，进而降低其荧光素酶的活性。因此
17、本课题的目的之三是初步研究 miR-559 和 miR-548d-3p 在参与调控HER2 基因表达方面的作用，为 HER2 基因分子靶向治疗提供一定的基础数据。 研究方法： 1.应用免疫组织化学法(IHC)分别检测 52 例人乳腺癌组织中HER2 蛋白、ER 蛋白、PR 蛋白的表达。应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测 52例人乳腺癌组织中 HER2 基因的表达，以及 17 号染色体的表达。 2.收集乳腺癌病例的临床资料：绝经年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、术后分期等。 3.应用统计学方法分析 HER2 基因与 HER2 蛋白、预后因素、激素受体表达的关系；分析 17 号染色体倍体性与 HER
18、2 基因、HER2 蛋白，预后因素、激素受体表达的关系。 4.用生物信息学的方法预测与 HER23-UTR 有互补结合位点的miRNAs 并计算其自由能(G):本课题中通过生物信息学的方法，选取 miR-559和 m1R-548d-3p 作为我们的目的 miRNAs。采用 mFold Software 分析 HER23-UTR 与 miR-559、miR-548-3p 互补结合位点 5端与 3端各 70 个核苷酸序列的自由能，从而预测此位点的可接近性。 5.重组质粒的构建：将 618bp 的HER23-UTR 的基因序列；611bp 的缺失了 miR-559 种子位点(TTACTTT)的HER
19、23#39;-UTR 基因序列；611bp 的缺失了 miR-548-3p 种子位点(GTTTTTA)的HER23#39;-UTR 基因序列亚克隆到 pMIR-Luc 载体中荧光素酶基因开放阅读框的下游，并通过测序来验证其方向性和正确性。 6.转染和荧光素酶活性的检测：上述不同的重组载体与 -gal 对照载体，以及相应浓度的不同的miRNAs 前体一同转染入 Hela 细胞，不同的 miRNAs 前体包括阴性对照前体、m1R-559 前体、miR-548d-3p 或 m1R-559 加上-548d-3p 前体；转染后 48 小时检测荧光素酶活性。 研究结论： 1.52 例患者中 HER2 基因
20、过表达的比例为38。 2.HER 蛋白 IHC 检测和 HER2 基因 FISH 法总体上具有明显的相关性，但在 IHC2+的情况存在结果不一致的现象，而对于 IHC2+的患者应进一步作FISH 检测以明确诊断。 3.HER2 扩增与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 4.52 例样本中乳腺癌非整体性的比例约为 44。 5.17 号染色体的表达水平分别与 HER2 基因及蛋白表达水平呈正相关。 6.17 号染色体的表达水平的增高与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 7.miR-548d-3p 和 miR-559 两个miRNAs 均能分别与 HER2 基因的 mRNA 的 3#39;-UTR 起到特异
21、性的识别和结合作用，进而翻译抑制重组载体荧光素酶蛋白的表达，降低荧光素酶的活性，且其效力与转染的 miRNAs 前体的浓度呈正相关。而 miR-548d-3p 和 miR-559 两个 miRNAs 联合共转染后明显地表现出高于其中一个单独转染的协同地翻译抑制作用。由此初步证实 miR-548d-3p 和 miR-559 参与 HER2 基因的调控，为进一步研究探索抑制或阻断 HER2 基因表达的分子靶向治疗提供理论和实践的数据。背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在细胞，生长过程中扮演者重要角色的两大类基因。而原癌基因 HER2 的扩增是与乳腺癌相关的基因表达中最常见的改变。HER2 基因位于
22、 17 号染色体，编码一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体。在乳腺浸润性导管癌中 HER2 基因扩增或蛋白过表达的发生率约为2030。有研究表明 HER2 基因扩增或蛋白过表达不仅是重要的与乳腺癌不良预后相关生物学标记，而且是对乳腺癌化疗及内分泌治疗反应具有指导作用的生物学标记，虽然关于 HER2 能否作为确实可行的预后指标尚有不同的观点，然而对 HER2 表达状态的检测已成为最佳化乳腺癌治疗方案的重要步骤。免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)已成为检测 HER2 表达状态的两种最常用的方法。而且均被国内和国际的治疗指南所推崇但究竟谁是检测 HER2 表达状态最佳的方法？是 IH
23、C 的蛋白检测法？还是 FISH 的基因检测法？ 因此，本课题的目的之一是在当地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者关于 HER2 状态检测的 FISH 和IHC 两种方法的相关性以及乳腺癌 HER2 基因表达与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为关于 HER2 基因在乳癌患者中表达比例的流行病学资料提供一些数据，为临床推广建立 FISH 检测奠定一定的基础。 在浸润性乳腺癌病例中常常伴随着 17 号染色体拷贝数的异常改变，其拷贝数可通过常规的遗传学方法和 FISH 检测来判断。而这种改变常常影响到 HER2 基因的扩增和蛋白的表达。Watters 和他的同事发现 17 号染色体拷贝数的异常改
24、变与组织分级 III 和ER 阴性的的病例相关，但对生存期无明显影响；另有研究提示 17 号染色体拷贝数的异常改变与乳腺癌不良预后因素相关。 因此，本课题的目的之二是当地的人群中研究乳腺癌患者 17 号染色体非整体性的发生率；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因表达及 HER2 蛋白表达的相关性。以及 17 号染色体拷贝数与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为探讨 17 号染色体倍体性这一遗传特征与乳腺癌生物学行为及预后的关系提供依据，进而为综合评估乳腺癌预后提供参考指标。 MicroRNA 简称 miRNAs 是生物体内固有的单链、非蛋白编码的长约 22 nt 的小分子 RNA
25、，它们主要通过与靶 mRNA 的结合以转录后的方式调控着基因表达，成熟 miRNAs 通过其 5第 2-8 个核苷酸(种子序列)与它们的靶 mRNAs 的 3-UTR 内的互补位点结合而识别其靶 mRNAs，通过使其靶 mRNAs的翻译抑制或降解来抑制基因表达，它们己成为基因表达的重要调节因子。功能学研究表明 miRNAs 参与调控着细胞的增殖、分化和死亡。有研究提示，在肿瘤细胞中 miRNAs 存在着异常的表达或突变，这表明 miRNAs 可能成为一类新的原癌基因或抑癌基因。鉴于 miRNAs 在肿瘤疾病发生发展的作用，通过干预肿瘤细胞内 miRNAs 的水平来进行肿瘤的治疗的策略逐渐形成。
26、就与 HER2 基因相关的 miRNAs 而言，有研究提示在小叶癌和导管癌 HER2 阳性和 HER2 阴性标本的对比中并未发现有 miRNAs 的异常改变，另一近期的研究表明在 193 例原发的乳腺癌组织中 miRNAs 表达谱的测定中未发现特异性的 miRNAs 与肿瘤分期、血管浸润、Her2 表达相关。因此作用于 HER2 基因的天然 miRNAs 目前并未有确切的研究结果。在本文中，我们应用生物信息学的方法选定两个不同保守性的与HER23-UTR 有互补结合位点的 miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，随之应用ThepMIR_REPORTTM miRNAs 表达报告载
27、体进行验证，即当特定的 miRNAs 与重组载体上的目标 mRNA 结合时，能阻断其蛋白的表达，进而降低其荧光素酶的活性。因此本课题的目的之三是初步研究 miR-559 和 miR-548d-3p 在参与调控HER2 基因表达方面的作用，为 HER2 基因分子靶向治疗提供一定的基础数据。 研究方法： 1.应用免疫组织化学法(IHC)分别检测 52 例人乳腺癌组织中HER2 蛋白、ER 蛋白、PR 蛋白的表达。应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测 52例人乳腺癌组织中 HER2 基因的表达，以及 17 号染色体的表达。 2.收集乳腺癌病例的临床资料：绝经年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、术后分期等。
28、 3.应用统计学方法分析 HER2 基因与 HER2 蛋白、预后因素、激素受体表达的关系；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因、HER2 蛋白，预后因素、激素受体表达的关系。 4.用生物信息学的方法预测与 HER23-UTR 有互补结合位点的miRNAs 并计算其自由能(G):本课题中通过生物信息学的方法，选取 miR-559和 m1R-548d-3p 作为我们的目的 miRNAs。采用 mFold Software 分析 HER23-UTR 与 miR-559、miR-548-3p 互补结合位点 5端与 3端各 70 个核苷酸序列的自由能，从而预测此位点的可接近性。 5.重组质粒的构
29、建：将 618bp 的HER23-UTR 的基因序列；611bp 的缺失了 miR-559 种子位点(TTACTTT)的HER23#39;-UTR 基因序列；611bp 的缺失了 miR-548-3p 种子位点(GTTTTTA)的HER23#39;-UTR 基因序列亚克隆到 pMIR-Luc 载体中荧光素酶基因开放阅读框的下游，并通过测序来验证其方向性和正确性。 6.转染和荧光素酶活性的检测：上述不同的重组载体与 -gal 对照载体，以及相应浓度的不同的miRNAs 前体一同转染入 Hela 细胞，不同的 miRNAs 前体包括阴性对照前体、m1R-559 前体、miR-548d-3p 或 m
30、1R-559 加上-548d-3p 前体；转染后 48 小时检测荧光素酶活性。 研究结论： 1.52 例患者中 HER2 基因过表达的比例为38。 2.HER 蛋白 IHC 检测和 HER2 基因 FISH 法总体上具有明显的相关性，但在 IHC2+的情况存在结果不一致的现象，而对于 IHC2+的患者应进一步作FISH 检测以明确诊断。 3.HER2 扩增与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 4.52 例样本中乳腺癌非整体性的比例约为 44。 5.17 号染色体的表达水平分别与 HER2 基因及蛋白表达水平呈正相关。 6.17 号染色体的表达水平的增高与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 7.miR-
31、548d-3p 和 miR-559 两个miRNAs 均能分别与 HER2 基因的 mRNA 的 3#39;-UTR 起到特异性的识别和结合作用，进而翻译抑制重组载体荧光素酶蛋白的表达，降低荧光素酶的活性，且其效力与转染的 miRNAs 前体的浓度呈正相关。而 miR-548d-3p 和 miR-559 两个 miRNAs 联合共转染后明显地表现出高于其中一个单独转染的协同地翻译抑制作用。由此初步证实 miR-548d-3p 和 miR-559 参与 HER2 基因的调控，为进一步研究探索抑制或阻断 HER2 基因表达的分子靶向治疗提供理论和实践的数据。背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在细胞
32、，生长过程中扮演者重要角色的两大类基因。而原癌基因 HER2 的扩增是与乳腺癌相关的基因表达中最常见的改变。HER2 基因位于 17 号染色体，编码一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体。在乳腺浸润性导管癌中 HER2 基因扩增或蛋白过表达的发生率约为2030。有研究表明 HER2 基因扩增或蛋白过表达不仅是重要的与乳腺癌不良预后相关生物学标记，而且是对乳腺癌化疗及内分泌治疗反应具有指导作用的生物学标记，虽然关于 HER2 能否作为确实可行的预后指标尚有不同的观点，然而对 HER2 表达状态的检测已成为最佳化乳腺癌治疗方案的重要步骤。免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)已成为检测
33、HER2 表达状态的两种最常用的方法。而且均被国内和国际的治疗指南所推崇但究竟谁是检测 HER2 表达状态最佳的方法？是 IHC 的蛋白检测法？还是 FISH 的基因检测法？ 因此，本课题的目的之一是在当地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者关于 HER2 状态检测的 FISH 和IHC 两种方法的相关性以及乳腺癌 HER2 基因表达与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为关于 HER2 基因在乳癌患者中表达比例的流行病学资料提供一些数据，为临床推广建立 FISH 检测奠定一定的基础。 在浸润性乳腺癌病例中常常伴随着 17 号染色体拷贝数的异常改变，其拷贝数可通过常规的遗传学方法和 FISH 检
34、测来判断。而这种改变常常影响到 HER2 基因的扩增和蛋白的表达。Watters 和他的同事发现 17 号染色体拷贝数的异常改变与组织分级 III 和ER 阴性的的病例相关，但对生存期无明显影响；另有研究提示 17 号染色体拷贝数的异常改变与乳腺癌不良预后因素相关。 因此，本课题的目的之二是当地的人群中研究乳腺癌患者 17 号染色体非整体性的发生率；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因表达及 HER2 蛋白表达的相关性。以及 17 号染色体拷贝数与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为探讨 17 号染色体倍体性这一遗传特征与乳腺癌生物学行为及预后的关系提供依据，进而为综合评估乳腺癌
35、预后提供参考指标。 MicroRNA 简称 miRNAs 是生物体内固有的单链、非蛋白编码的长约 22 nt 的小分子 RNA，它们主要通过与靶 mRNA 的结合以转录后的方式调控着基因表达，成熟 miRNAs 通过其 5第 2-8 个核苷酸(种子序列)与它们的靶 mRNAs 的 3-UTR 内的互补位点结合而识别其靶 mRNAs，通过使其靶 mRNAs的翻译抑制或降解来抑制基因表达，它们己成为基因表达的重要调节因子。功能学研究表明 miRNAs 参与调控着细胞的增殖、分化和死亡。有研究提示，在肿瘤细胞中 miRNAs 存在着异常的表达或突变，这表明 miRNAs 可能成为一类新的原癌基因或抑
36、癌基因。鉴于 miRNAs 在肿瘤疾病发生发展的作用，通过干预肿瘤细胞内 miRNAs 的水平来进行肿瘤的治疗的策略逐渐形成。就与 HER2 基因相关的 miRNAs 而言，有研究提示在小叶癌和导管癌 HER2 阳性和 HER2 阴性标本的对比中并未发现有 miRNAs 的异常改变，另一近期的研究表明在 193 例原发的乳腺癌组织中 miRNAs 表达谱的测定中未发现特异性的 miRNAs 与肿瘤分期、血管浸润、Her2 表达相关。因此作用于 HER2 基因的天然 miRNAs 目前并未有确切的研究结果。在本文中，我们应用生物信息学的方法选定两个不同保守性的与HER23-UTR 有互补结合位点
37、的 miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，随之应用ThepMIR_REPORTTM miRNAs 表达报告载体进行验证，即当特定的 miRNAs 与重组载体上的目标 mRNA 结合时，能阻断其蛋白的表达，进而降低其荧光素酶的活性。因此本课题的目的之三是初步研究 miR-559 和 miR-548d-3p 在参与调控HER2 基因表达方面的作用，为 HER2 基因分子靶向治疗提供一定的基础数据。 研究方法： 1.应用免疫组织化学法(IHC)分别检测 52 例人乳腺癌组织中HER2 蛋白、ER 蛋白、PR 蛋白的表达。应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测 52例人乳腺癌组织中
38、HER2 基因的表达，以及 17 号染色体的表达。 2.收集乳腺癌病例的临床资料：绝经年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、术后分期等。 3.应用统计学方法分析 HER2 基因与 HER2 蛋白、预后因素、激素受体表达的关系；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因、HER2 蛋白，预后因素、激素受体表达的关系。 4.用生物信息学的方法预测与 HER23-UTR 有互补结合位点的miRNAs 并计算其自由能(G):本课题中通过生物信息学的方法，选取 miR-559和 m1R-548d-3p 作为我们的目的 miRNAs。采用 mFold Software 分析 HER23-UTR 与 miR-559
39、、miR-548-3p 互补结合位点 5端与 3端各 70 个核苷酸序列的自由能，从而预测此位点的可接近性。 5.重组质粒的构建：将 618bp 的HER23-UTR 的基因序列；611bp 的缺失了 miR-559 种子位点(TTACTTT)的HER23#39;-UTR 基因序列；611bp 的缺失了 miR-548-3p 种子位点(GTTTTTA)的HER23#39;-UTR 基因序列亚克隆到 pMIR-Luc 载体中荧光素酶基因开放阅读框的下游，并通过测序来验证其方向性和正确性。 6.转染和荧光素酶活性的检测：上述不同的重组载体与 -gal 对照载体，以及相应浓度的不同的miRNAs 前
40、体一同转染入 Hela 细胞，不同的 miRNAs 前体包括阴性对照前体、m1R-559 前体、miR-548d-3p 或 m1R-559 加上-548d-3p 前体；转染后 48 小时检测荧光素酶活性。 研究结论： 1.52 例患者中 HER2 基因过表达的比例为38。 2.HER 蛋白 IHC 检测和 HER2 基因 FISH 法总体上具有明显的相关性，但在 IHC2+的情况存在结果不一致的现象，而对于 IHC2+的患者应进一步作FISH 检测以明确诊断。 3.HER2 扩增与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 4.52 例样本中乳腺癌非整体性的比例约为 44。 5.17 号染色体的表达水平分
41、别与 HER2 基因及蛋白表达水平呈正相关。 6.17 号染色体的表达水平的增高与乳腺癌不良预后指标有密切相关。 7.miR-548d-3p 和 miR-559 两个miRNAs 均能分别与 HER2 基因的 mRNA 的 3#39;-UTR 起到特异性的识别和结合作用，进而翻译抑制重组载体荧光素酶蛋白的表达，降低荧光素酶的活性，且其效力与转染的 miRNAs 前体的浓度呈正相关。而 miR-548d-3p 和 miR-559 两个 miRNAs 联合共转染后明显地表现出高于其中一个单独转染的协同地翻译抑制作用。由此初步证实 miR-548d-3p 和 miR-559 参与 HER2 基因的调
42、控，为进一步研究探索抑制或阻断 HER2 基因表达的分子靶向治疗提供理论和实践的数据。背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在细胞，生长过程中扮演者重要角色的两大类基因。而原癌基因 HER2 的扩增是与乳腺癌相关的基因表达中最常见的改变。HER2 基因位于 17 号染色体，编码一种跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体。在乳腺浸润性导管癌中 HER2 基因扩增或蛋白过表达的发生率约为2030。有研究表明 HER2 基因扩增或蛋白过表达不仅是重要的与乳腺癌不良预后相关生物学标记，而且是对乳腺癌化疗及内分泌治疗反应具有指导作用的生物学标记，虽然关于 HER2 能否作为确实可行的预后指标尚有不同的观点，
43、然而对 HER2 表达状态的检测已成为最佳化乳腺癌治疗方案的重要步骤。免疫组化(IHC)和荧光原位杂交(FISH)已成为检测 HER2 表达状态的两种最常用的方法。而且均被国内和国际的治疗指南所推崇但究竟谁是检测 HER2 表达状态最佳的方法？是 IHC 的蛋白检测法？还是 FISH 的基因检测法？ 因此，本课题的目的之一是在当地的人群中前瞻性的研究乳腺癌患者关于 HER2 状态检测的 FISH 和IHC 两种方法的相关性以及乳腺癌 HER2 基因表达与乳腺癌临床预后因素、激素受体表达的关系。为关于 HER2 基因在乳癌患者中表达比例的流行病学资料提供一些数据，为临床推广建立 FISH 检测奠
44、定一定的基础。 在浸润性乳腺癌病例中常常伴随着 17 号染色体拷贝数的异常改变，其拷贝数可通过常规的遗传学方法和 FISH 检测来判断。而这种改变常常影响到 HER2 基因的扩增和蛋白的表达。Watters 和他的同事发现 17 号染色体拷贝数的异常改变与组织分级 III 和ER 阴性的的病例相关，但对生存期无明显影响；另有研究提示 17 号染色体拷贝数的异常改变与乳腺癌不良预后因素相关。 因此，本课题的目的之二是当地的人群中研究乳腺癌患者 17 号染色体非整体性的发生率；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因表达及 HER2 蛋白表达的相关性。以及 17 号染色体拷贝数与乳腺癌临床预后
45、因素、激素受体表达的关系。为探讨 17 号染色体倍体性这一遗传特征与乳腺癌生物学行为及预后的关系提供依据，进而为综合评估乳腺癌预后提供参考指标。 MicroRNA 简称 miRNAs 是生物体内固有的单链、非蛋白编码的长约 22 nt 的小分子 RNA，它们主要通过与靶 mRNA 的结合以转录后的方式调控着基因表达，成熟 miRNAs 通过其 5第 2-8 个核苷酸(种子序列)与它们的靶 mRNAs 的 3-UTR 内的互补位点结合而识别其靶 mRNAs，通过使其靶 mRNAs的翻译抑制或降解来抑制基因表达，它们己成为基因表达的重要调节因子。功能学研究表明 miRNAs 参与调控着细胞的增殖、
46、分化和死亡。有研究提示，在肿瘤细胞中 miRNAs 存在着异常的表达或突变，这表明 miRNAs 可能成为一类新的原癌基因或抑癌基因。鉴于 miRNAs 在肿瘤疾病发生发展的作用，通过干预肿瘤细胞内 miRNAs 的水平来进行肿瘤的治疗的策略逐渐形成。就与 HER2 基因相关的 miRNAs 而言，有研究提示在小叶癌和导管癌 HER2 阳性和 HER2 阴性标本的对比中并未发现有 miRNAs 的异常改变，另一近期的研究表明在 193 例原发的乳腺癌组织中 miRNAs 表达谱的测定中未发现特异性的 miRNAs 与肿瘤分期、血管浸润、Her2 表达相关。因此作用于 HER2 基因的天然 mi
47、RNAs 目前并未有确切的研究结果。在本文中，我们应用生物信息学的方法选定两个不同保守性的与HER23-UTR 有互补结合位点的 miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，随之应用ThepMIR_REPORTTM miRNAs 表达报告载体进行验证，即当特定的 miRNAs 与重组载体上的目标 mRNA 结合时，能阻断其蛋白的表达，进而降低其荧光素酶的活性。因此本课题的目的之三是初步研究 miR-559 和 miR-548d-3p 在参与调控HER2 基因表达方面的作用，为 HER2 基因分子靶向治疗提供一定的基础数据。 研究方法： 1.应用免疫组织化学法(IHC)分别检测 52
48、 例人乳腺癌组织中HER2 蛋白、ER 蛋白、PR 蛋白的表达。应用荧光原位杂交(FISH)的方法检测 52例人乳腺癌组织中 HER2 基因的表达，以及 17 号染色体的表达。 2.收集乳腺癌病例的临床资料：绝经年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、术后分期等。 3.应用统计学方法分析 HER2 基因与 HER2 蛋白、预后因素、激素受体表达的关系；分析 17 号染色体倍体性与 HER2 基因、HER2 蛋白，预后因素、激素受体表达的关系。 4.用生物信息学的方法预测与 HER23-UTR 有互补结合位点的miRNAs 并计算其自由能(G):本课题中通过生物信息学的方法，选取 miR-559和 m1R-
49、548d-3p 作为我们的目的 miRNAs。采用 mFold Software 分析 HER23-UTR 与 miR-559、miR-548-3p 互补结合位点 5端与 3端各 70 个核苷酸序列的自由能，从而预测此位点的可接近性。 5.重组质粒的构建：将 618bp 的HER23-UTR 的基因序列；611bp 的缺失了 miR-559 种子位点(TTACTTT)的HER23#39;-UTR 基因序列；611bp 的缺失了 miR-548-3p 种子位点(GTTTTTA)的HER23#39;-UTR 基因序列亚克隆到 pMIR-Luc 载体中荧光素酶基因开放阅读框的下游，并通过测序来验证其方向性和正确性。 6.转染和荧光素酶活性的检测：上述不同的重组载体与 -gal 对照载体，以及相应浓度的不同的miRNAs 前体一同转染入 Hela 细胞，不同的 miRNAs 前体包括阴性对照前体、m1R-559 前体、miR-548d-3p 或 m1R-559 加上
