1、病原生物学专业毕业论文 精品论文 EBV-LMP2 多表位肽免疫效应的研究关键词：EBV 潜伏膜蛋白 2 表位疫苗 B 细胞表位 CTL 细胞表位 免疫效应摘要：目的： 1.预测和筛选 EBV-LMP2 多表位肽：预测 EB 病毒(EBV)潜伏膜蛋白 2(LMP2)的 CTL 和 Th 细胞表位，选择评分较高的 CTL 和 Th 表位，并结合本实验室预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，获得 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.EBV-LMP2 多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表达和纯化：构建含 EBV-LMP2多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽，经 I
2、PTG 诱导后用Western blot 进行特异性鉴定。采用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2 多表位肽。同时纯化 pET32a(+)表达的 His 蛋白用于动物免疫和ELISA 检测的对照研究。 3.利用小鼠检测 EBV-LMP2 多表位肽的免疫原性：将纯化的 EBV-LMP2 多表位肽和 His 蛋白分别免疫 BALB/c 小鼠，隔周免疫，共3 次。采用 ELISA 方法分析免疫后小鼠血清 IgG 及阴道分泌物 sIgA 水平及维持时间，并采用 EBV 抗原(B95-8 细胞制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后1w 无菌取小鼠脾细胞用 LDH 释放法进行 CTL
3、 杀伤活性分析，以检测 EBV-LMP2多表位肽免疫小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了 EBV-LMP2多表位肽免疫原性，为 EBV 感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。 方法： 1.以 EBV 标准株(B95-8 细胞)LMP2 的完整氨基酸序列(497aa)为基础，应用在线预测网站 SYFPEITHI(http：/www.syfpeithi.de/)，预测 EBV-LMP2 的 H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501 等限制性表位，尤其是 HLA-A*02
4、01、HLA-A*2402、H2-kd 重叠的区域，选择含 CTL、Th 表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，选择 B 细胞表位及 CTL、Th 细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。 2.将 EBV-LMP2 多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒 pET32a(+)，构建含有 His 标签的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽。经 IPTG 诱导表达后的融合蛋白进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，并用 Western blot 鉴定其免疫原性，用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽
5、及 His 蛋白。 3.选择 68 周龄雌性BALB/c 小鼠，分 3 组，即 EBV-LMP2 多表位肽组、His 蛋白组及 PBS 组，每组 9只。将纯化后的融合蛋白 EBV LMP2 多表位肽及 His 蛋白与佐剂等体积混匀后按照 50g/只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后 1w 断尾取血并收集阴道分泌物，采用 ELISA 法检测血清中特异性 IgG 和阴道分泌物中特异性 sIgA 水平。同时，于术次免疫后 1w，每组随机取 3 只小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞进行 CTL 细胞特异性杀伤活性检测，采用乳酸脱氢酶 LDH 释放法检测其特异性细胞
6、免疫效应。其余小鼠持续检测其特异性血清 IgG 和阴道分泌物特异性 sIgA 的持续水平直至第 7w。 结果：1.从 SYFPEITHI 网站预测到的候选 CTL 和 Th 表位中选择出 19 条评分较高的肽段，结合本实验室已经预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，选择 CTL 和 Th 细胞富集的肽段，即 EBV-LMP2195-232 和 EBV-LMP2419-435 肽段，将两段序列串联，即得到 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.酶切鉴定和核苷酸测序结果表明，成功构建了含有 EBV-LMP2 多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽。SDS-PAG
7、E 分析，在 37，1.0mM IPTG 作用下诱导 6hr 能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为 27kDa，与预期 Mr 大小吻合；蛋白表达量约占细菌总蛋白量的 23。Western Blot 结果显示，以 HRP 标记的小鼠抗 His-IgG(H+L)作为一抗，则可见单一明显条带，与 SDS-PAGE 中位置吻合。用 Ni-NTA 树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽和 pET32a(+)所表达的His 蛋白。 3.BALB/c 小鼠经融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽免疫后，可获得高效价的血清特异性 IgG。血清抗体效价随免疫次数增加而升高，自
8、第 1w 开始升高，可持续至第 7w。用融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被并将血清按1：100 稀释，检测第 7w 小鼠 IgG 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(1.1780.130)，His 蛋白组及 PBS 组分别为(0.4680.121)，(0.0160.008)；EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His 蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 4.三组小鼠阴道分泌物特异性 sIgA 自第 3w 开始升高，至第 5w 达到高峰，然后下降。用融合蛋白 EBV-LMP2
9、多表位肽蛋白包被检测第 5w 小鼠 sIgA 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(0.7540.064)，His 蛋白组和 PBS 组分别为(0.4550.038)，(0.1710.018)； EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His 蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 5.免疫小鼠 CTL 特异性的杀伤活性结果显示，随着效靶比的增加，EBV-LMP2 多表位肽组的特异性杀伤率逐渐升高。效靶比为 5：1、10：1、25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组的杀伤率分别为(12.522
10、.59)、(21.801.080)和(23.683.74)，His 蛋白组和 PBS组相应效靶比杀伤率分别为(3.721.18)，(4.350.85)，(7.152.09)和(2.291.05)，(4.120.42)，(4.930.10)。经统计分析，效靶比为 5：1，10：1 和 25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组与 His 蛋白组和 PBS 组相比均有显著性差差异 Plt;0.05)，而 His 蛋白组和 PBS 组相比则无显著性差异(Pgt;0.05)。 结论： 1.预测并筛选了 19 个可能的 EBV-LMP2 的CTL 表位和 Th 表位，结合本实验室已经预测的 B 细胞表位
11、1，确定了 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.通过分子克隆技术，成功构建了含 EBV-LMP2 多表位肽的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽；在原核表达系统表达了多表位蛋白 EBV-LMP2 多表位肽；通过亲和层析法得到了纯化的 EBV-LMP2 多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠的血清学检测结果表明，EB V-LMP2 多表位肽能刺激机体产生全身及局部的特异性抗体：血清特异性抗体 IgG效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开始升高，可持续至第 7w；阴道分泌物特异性 sIgA 自第 3w 开始升高，到第 5w 达高峰，然后下降。 4.
12、乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测 CTL 特异性杀伤结果显示，EBV-LMP2 多表位肽可以刺激机体产生较明显的特异性的 CTL 杀伤活性。本研究筛选的 EBV-LMP2 多表位肽，具有较强的免疫原性。正文内容目的： 1.预测和筛选 EBV-LMP2 多表位肽：预测 EB 病毒(EBV)潜伏膜蛋白 2(LMP2)的 CTL 和 Th 细胞表位，选择评分较高的 CTL 和 Th 表位，并结合本实验室预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，获得 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.EBV-LMP2 多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表达和纯化：构建含 EBV-LMP2多表位肽的原核重组质粒 pET3
13、2a(+)/EBV-LMP2 多表位肽，经 IPTG 诱导后用Western blot 进行特异性鉴定。采用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2 多表位肽。同时纯化 pET32a(+)表达的 His 蛋白用于动物免疫和ELISA 检测的对照研究。 3.利用小鼠检测 EBV-LMP2 多表位肽的免疫原性：将纯化的 EBV-LMP2 多表位肽和 His 蛋白分别免疫 BALB/c 小鼠，隔周免疫，共3 次。采用 ELISA 方法分析免疫后小鼠血清 IgG 及阴道分泌物 sIgA 水平及维持时间，并采用 EBV 抗原(B95-8 细胞制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后1w
14、无菌取小鼠脾细胞用 LDH 释放法进行 CTL 杀伤活性分析，以检测 EBV-LMP2多表位肽免疫小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了 EBV-LMP2多表位肽免疫原性，为 EBV 感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。 方法： 1.以 EBV 标准株(B95-8 细胞)LMP2 的完整氨基酸序列(497aa)为基础，应用在线预测网站 SYFPEITHI(http：/www.syfpeithi.de/)，预测 EBV-LMP2 的 H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1
15、501 等限制性表位，尤其是 HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd 重叠的区域，选择含 CTL、Th 表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，选择 B 细胞表位及 CTL、Th 细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。 2.将 EBV-LMP2 多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒 pET32a(+)，构建含有 His 标签的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽。经 IPTG 诱导表达后的融合蛋白进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，并用 Western blot 鉴定其免疫原性，用 Ni-NTA 树脂亲和
16、层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽及 His 蛋白。 3.选择 68 周龄雌性BALB/c 小鼠，分 3 组，即 EBV-LMP2 多表位肽组、His 蛋白组及 PBS 组，每组 9只。将纯化后的融合蛋白 EBV LMP2 多表位肽及 His 蛋白与佐剂等体积混匀后按照 50g/只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后 1w 断尾取血并收集阴道分泌物，采用 ELISA 法检测血清中特异性 IgG 和阴道分泌物中特异性 sIgA 水平。同时，于术次免疫后 1w，每组随机取 3 只小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞进行 CTL 细胞特异性杀伤活性检测，
17、采用乳酸脱氢酶 LDH 释放法检测其特异性细胞免疫效应。其余小鼠持续检测其特异性血清 IgG 和阴道分泌物特异性 sIgA 的持续水平直至第 7w。 结果：1.从 SYFPEITHI 网站预测到的候选 CTL 和 Th 表位中选择出 19 条评分较高的肽段，结合本实验室已经预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，选择 CTL 和 Th 细胞富集的肽段，即 EBV-LMP2195-232 和 EBV-LMP2419-435 肽段，将两段序列串联，即得到 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.酶切鉴定和核苷酸测序结果表明，成功构建了含有 EBV-LMP2 多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+
18、)/EBV-LMP2 多表位肽。SDS-PAGE 分析，在 37，1.0mM IPTG 作用下诱导 6hr 能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为 27kDa，与预期 Mr 大小吻合；蛋白表达量约占细菌总蛋白量的 23。Western Blot 结果显示，以 HRP 标记的小鼠抗 His-IgG(H+L)作为一抗，则可见单一明显条带，与 SDS-PAGE 中位置吻合。用 Ni-NTA 树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽和 pET32a(+)所表达的His 蛋白。 3.BALB/c 小鼠经融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽免疫后，可获得高效价的血清特异性
19、 IgG。血清抗体效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开始升高，可持续至第 7w。用融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被并将血清按1：100 稀释，检测第 7w 小鼠 IgG 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(1.1780.130)，His 蛋白组及 PBS 组分别为(0.4680.121)，(0.0160.008)；EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His 蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 4.三组小鼠阴道分泌物特异性 sIgA 自第 3w 开始升高，至第 5w 达到
20、高峰，然后下降。用融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被检测第 5w 小鼠 sIgA 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(0.7540.064)，His 蛋白组和 PBS 组分别为(0.4550.038)，(0.1710.018)； EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His 蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 5.免疫小鼠 CTL 特异性的杀伤活性结果显示，随着效靶比的增加，EBV-LMP2 多表位肽组的特异性杀伤率逐渐升高。效靶比为 5：1、10：1、25：1 时，EBV-L
21、MP2 多表位肽组的杀伤率分别为(12.522.59)、(21.801.080)和(23.683.74)，His 蛋白组和 PBS组相应效靶比杀伤率分别为(3.721.18)，(4.350.85)，(7.152.09)和(2.291.05)，(4.120.42)，(4.930.10)。经统计分析，效靶比为 5：1，10：1 和 25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组与 His 蛋白组和 PBS 组相比均有显著性差差异 Plt;0.05)，而 His 蛋白组和 PBS 组相比则无显著性差异(Pgt;0.05)。 结论： 1.预测并筛选了 19 个可能的 EBV-LMP2 的CTL 表位和 T
22、h 表位，结合本实验室已经预测的 B 细胞表位1，确定了 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.通过分子克隆技术，成功构建了含 EBV-LMP2 多表位肽的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽；在原核表达系统表达了多表位蛋白 EBV-LMP2 多表位肽；通过亲和层析法得到了纯化的 EBV-LMP2 多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠的血清学检测结果表明，EB V-LMP2 多表位肽能刺激机体产生全身及局部的特异性抗体：血清特异性抗体 IgG效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开始升高，可持续至第 7w；阴道分泌物特异性 sIgA 自第 3w
23、开始升高，到第 5w 达高峰，然后下降。 4.乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测 CTL 特异性杀伤结果显示，EBV-LMP2 多表位肽可以刺激机体产生较明显的特异性的 CTL 杀伤活性。本研究筛选的 EBV-LMP2 多表位肽，具有较强的免疫原性。目的： 1.预测和筛选 EBV-LMP2 多表位肽：预测 EB 病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的 CTL 和 Th 细胞表位，选择评分较高的 CTL 和 Th 表位，并结合本实验室预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，获得 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.EBV-LMP2 多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表达和纯化：构建含 EBV-LM
24、P2 多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽，经 IPTG 诱导后用 Western blot 进行特异性鉴定。采用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽。同时纯化 pET32a(+)表达的 His 蛋白用于动物免疫和 ELISA 检测的对照研究。 3.利用小鼠检测 EBV-LMP2 多表位肽的免疫原性：将纯化的 EBV-LMP2 多表位肽和 His 蛋白分别免疫 BALB/c 小鼠，隔周免疫，共 3 次。采用ELISA 方法分析免疫后小鼠血清 IgG 及阴道分泌物 sIgA 水平及维持时间，并采用 EBV 抗原(B95-8 细胞
25、制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后 1w 无菌取小鼠脾细胞用 LDH 释放法进行 CTL 杀伤活性分析，以检测 EBV-LMP2 多表位肽免疫小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了 EBV-LMP2 多表位肽免疫原性，为 EBV 感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。 方法： 1.以 EBV 标准株(B95-8 细胞)LMP2 的完整氨基酸序列(497aa)为基础，应用在线预测网站 SYFPEITHI(http：/www.syfpeithi.de/)，预测 EBV-LMP2的 H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、H
26、LA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501 等限制性表位，尤其是 HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd 重叠的区域，选择含 CTL、Th 表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的 EBV-LMP2 B细胞表位1，选择 B 细胞表位及 CTL、Th 细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。 2.将 EBV-LMP2 多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒 pET32a(+)，构建含有 His 标签的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。经 IPTG 诱导表达后的融合蛋白进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，并用Western blot
27、鉴定其免疫原性，用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽及 His 蛋白。 3.选择 68 周龄雌性 BALB/c 小鼠，分 3 组，即 EBV-LMP2 多表位肽组、His 蛋白组及 PBS 组，每组 9 只。将纯化后的融合蛋白 EBV LMP2 多表位肽及 His 蛋白与佐剂等体积混匀后按照 50g/只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后 1w 断尾取血并收集阴道分泌物，采用 ELISA 法检测血清中特异性 IgG 和阴道分泌物中特异性 sIgA 水平。同时，于术次免疫后 1w，每组随机取 3 只小鼠，无菌取脾脏，制
28、备脾细胞进行 CTL 细胞特异性杀伤活性检测，采用乳酸脱氢酶LDH 释放法检测其特异性细胞免疫效应。其余小鼠持续检测其特异性血清 IgG和阴道分泌物特异性 sIgA 的持续水平直至第 7w。 结果： 1.从 SYFPEITHI网站预测到的候选 CTL 和 Th 表位中选择出 19 条评分较高的肽段，结合本实验室已经预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，选择 CTL 和 Th 细胞富集的肽段，即EBV-LMP2195-232 和 EBV-LMP2419-435 肽段，将两段序列串联，即得到 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.酶切鉴定和核苷酸测序结果表明，成功构建了含有EBV-LMP2 多
29、表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽。SDS-PAGE分析，在 37，1.0mM IPTG 作用下诱导 6hr 能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为 27kDa，与预期 Mr 大小吻合；蛋白表达量约占细菌总蛋白量的23。Western Blot 结果显示，以 HRP 标记的小鼠抗 His-IgG(H+L)作为一抗，则可见单一明显条带，与 SDS-PAGE 中位置吻合。用 Ni-NTA 树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽和 pET32a(+)所表达的 His 蛋白。 3.BALB/c 小鼠经融合蛋白 EBV-LMP2 多表
30、位肽免疫后，可获得高效价的血清特异性 IgG。血清抗体效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开始升高，可持续至第 7w。用融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被并将血清按 1：100 稀释，检测第 7w 小鼠 IgG 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(1.1780.130)，His 蛋白组及 PBS 组分别为(0.4680.121)，(0.0160.008)； EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 4.三组小鼠阴道分泌物特异性 sIgA
31、自第 3w 开始升高，至第 5w 达到高峰，然后下降。用融合蛋白EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被检测第 5w 小鼠 sIgA 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(0.7540.064)，His 蛋白组和 PBS 组分别为(0.4550.038)，(0.1710.018)； EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His 蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 5.免疫小鼠 CTL 特异性的杀伤活性结果显示，随着效靶比的增加，EBV-LMP2 多表位肽组的特异性杀伤率逐渐升高。效靶比为5：1、
32、10：1、25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组的杀伤率分别为(12.522.59)、(21.801.080)和(23.683.74)，His 蛋白组和 PBS 组相应效靶比杀伤率分别为(3.721.18)，(4.350.85)，(7.152.09)和(2.291.05)，(4.120.42)，(4.930.10)。经统计分析，效靶比为 5：1，10：1 和25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组与 His 蛋白组和 PBS 组相比均有显著性差差异Plt;0.05)，而 His 蛋白组和 PBS 组相比则无显著性差异(Pgt;0.05)。结论： 1.预测并筛选了 19 个可能的 EBV-
33、LMP2 的 CTL 表位和 Th 表位，结合本实验室已经预测的 B 细胞表位1，确定了 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.通过分子克隆技术，成功构建了含 EBV-LMP2 多表位肽的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽；在原核表达系统表达了多表位蛋白 EBV-LMP2 多表位肽；通过亲和层析法得到了纯化的 EBV-LMP2 多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠的血清学检测结果表明，EB V-LMP2 多表位肽能刺激机体产生全身及局部的特异性抗体：血清特异性抗体 IgG 效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开始升高，可持续至第 7w；阴道分
34、泌物特异性 sIgA 自第 3w 开始升高，到第 5w 达高峰，然后下降。 4.乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测 CTL 特异性杀伤结果显示，EBV-LMP2 多表位肽可以刺激机体产生较明显的特异性的CTL 杀伤活性。本研究筛选的 EBV-LMP2 多表位肽，具有较强的免疫原性。目的： 1.预测和筛选 EBV-LMP2 多表位肽：预测 EB 病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的 CTL 和 Th 细胞表位，选择评分较高的 CTL 和 Th 表位，并结合本实验室预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，获得 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.EBV-LMP2 多表位肽的基因克隆及其原核蛋白
35、表达和纯化：构建含 EBV-LMP2 多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽，经 IPTG 诱导后用 Western blot 进行特异性鉴定。采用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽。同时纯化 pET32a(+)表达的 His 蛋白用于动物免疫和 ELISA 检测的对照研究。 3.利用小鼠检测 EBV-LMP2 多表位肽的免疫原性：将纯化的 EBV-LMP2 多表位肽和 His 蛋白分别免疫 BALB/c 小鼠，隔周免疫，共 3 次。采用ELISA 方法分析免疫后小鼠血清 IgG 及阴道分泌物 sIgA 水平及维持时间，并采用
36、 EBV 抗原(B95-8 细胞制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后 1w 无菌取小鼠脾细胞用 LDH 释放法进行 CTL 杀伤活性分析，以检测 EBV-LMP2 多表位肽免疫小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了 EBV-LMP2 多表位肽免疫原性，为 EBV 感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。 方法： 1.以 EBV 标准株(B95-8 细胞)LMP2 的完整氨基酸序列(497aa)为基础，应用在线预测网站 SYFPEITHI(http：/www.syfpeithi.de/)，预测 EBV-LMP2的 H2-Kd、HLA-A*0201、HLA-A*2402
37、、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501 等限制性表位，尤其是 HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd 重叠的区域，选择含 CTL、Th 表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的 EBV-LMP2 B细胞表位1，选择 B 细胞表位及 CTL、Th 细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。 2.将 EBV-LMP2 多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒 pET32a(+)，构建含有 His 标签的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。经 IPTG 诱导表达后的融合蛋白进行 SDS-PAGE 蛋白电泳
38、，并用Western blot 鉴定其免疫原性，用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽及 His 蛋白。 3.选择 68 周龄雌性 BALB/c 小鼠，分 3 组，即 EBV-LMP2 多表位肽组、His 蛋白组及 PBS 组，每组 9 只。将纯化后的融合蛋白 EBV LMP2 多表位肽及 His 蛋白与佐剂等体积混匀后按照 50g/只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后 1w 断尾取血并收集阴道分泌物，采用 ELISA 法检测血清中特异性 IgG 和阴道分泌物中特异性 sIgA 水平。同时，于术次免疫后 1w，每组随
39、机取 3 只小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞进行 CTL 细胞特异性杀伤活性检测，采用乳酸脱氢酶LDH 释放法检测其特异性细胞免疫效应。其余小鼠持续检测其特异性血清 IgG和阴道分泌物特异性 sIgA 的持续水平直至第 7w。 结果： 1.从 SYFPEITHI网站预测到的候选 CTL 和 Th 表位中选择出 19 条评分较高的肽段，结合本实验室已经预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，选择 CTL 和 Th 细胞富集的肽段，即EBV-LMP2195-232 和 EBV-LMP2419-435 肽段，将两段序列串联，即得到 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.酶切鉴定和核苷酸测序结果表明，成
40、功构建了含有EBV-LMP2 多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽。SDS-PAGE分析，在 37，1.0mM IPTG 作用下诱导 6hr 能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(Mr)约为 27kDa，与预期 Mr 大小吻合；蛋白表达量约占细菌总蛋白量的23。Western Blot 结果显示，以 HRP 标记的小鼠抗 His-IgG(H+L)作为一抗，则可见单一明显条带，与 SDS-PAGE 中位置吻合。用 Ni-NTA 树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽和 pET32a(+)所表达的 His 蛋白。 3.BALB/c 小鼠经
41、融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽免疫后，可获得高效价的血清特异性 IgG。血清抗体效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开始升高，可持续至第 7w。用融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被并将血清按 1：100 稀释，检测第 7w 小鼠 IgG 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(1.1780.130)，His 蛋白组及 PBS 组分别为(0.4680.121)，(0.0160.008)； EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 4.三组
42、小鼠阴道分泌物特异性 sIgA 自第 3w 开始升高，至第 5w 达到高峰，然后下降。用融合蛋白EBV-LMP2 多表位肽蛋白包被检测第 5w 小鼠 sIgA 抗体水平：EBV-LMP2 多表位肽组 A 值为(0.7540.064)，His 蛋白组和 PBS 组分别为(0.4550.038)，(0.1710.018)； EBV-LMP2 多表位肽组分别与 His 蛋白组及 PBS 组相比，均有显著性差异(Plt;0.05)； His 蛋白组与 PBS 相比也有显著性差异(Plt;0.05)。 5.免疫小鼠 CTL 特异性的杀伤活性结果显示，随着效靶比的增加，EBV-LMP2 多表位肽组的特异性
43、杀伤率逐渐升高。效靶比为5：1、10：1、25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组的杀伤率分别为(12.522.59)、(21.801.080)和(23.683.74)，His 蛋白组和 PBS 组相应效靶比杀伤率分别为(3.721.18)，(4.350.85)，(7.152.09)和(2.291.05)，(4.120.42)，(4.930.10)。经统计分析，效靶比为 5：1，10：1 和25：1 时，EBV-LMP2 多表位肽组与 His 蛋白组和 PBS 组相比均有显著性差差异Plt;0.05)，而 His 蛋白组和 PBS 组相比则无显著性差异(Pgt;0.05)。结论： 1.预测并
44、筛选了 19 个可能的 EBV-LMP2 的 CTL 表位和 Th 表位，结合本实验室已经预测的 B 细胞表位1，确定了 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.通过分子克隆技术，成功构建了含 EBV-LMP2 多表位肽的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽；在原核表达系统表达了多表位蛋白 EBV-LMP2 多表位肽；通过亲和层析法得到了纯化的 EBV-LMP2 多表位肽融合蛋白。 3.多表位肽融合蛋白免疫 BALB/c 小鼠的血清学检测结果表明，EB V-LMP2 多表位肽能刺激机体产生全身及局部的特异性抗体：血清特异性抗体 IgG 效价随免疫次数增加而升高，自第 1w 开
45、始升高，可持续至第 7w；阴道分泌物特异性 sIgA 自第 3w 开始升高，到第 5w 达高峰，然后下降。 4.乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测 CTL 特异性杀伤结果显示，EBV-LMP2 多表位肽可以刺激机体产生较明显的特异性的CTL 杀伤活性。本研究筛选的 EBV-LMP2 多表位肽，具有较强的免疫原性。目的： 1.预测和筛选 EBV-LMP2 多表位肽：预测 EB 病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的 CTL 和 Th 细胞表位，选择评分较高的 CTL 和 Th 表位，并结合本实验室预测的 EBV-LMP2 B 细胞表位1，获得 EBV-LMP2 多表位肽序列。 2.EBV-LMP2
46、 多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表达和纯化：构建含 EBV-LMP2 多表位肽的原核重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2 多表位肽，经 IPTG 诱导后用 Western blot 进行特异性鉴定。采用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽。同时纯化 pET32a(+)表达的 His 蛋白用于动物免疫和 ELISA 检测的对照研究。 3.利用小鼠检测 EBV-LMP2 多表位肽的免疫原性：将纯化的 EBV-LMP2 多表位肽和 His 蛋白分别免疫 BALB/c 小鼠，隔周免疫，共 3 次。采用ELISA 方法分析免疫后小鼠血清 IgG 及阴道分泌物
47、sIgA 水平及维持时间，并采用 EBV 抗原(B95-8 细胞制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后 1w 无菌取小鼠脾细胞用 LDH 释放法进行 CTL 杀伤活性分析，以检测 EBV-LMP2 多表位肽免疫小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了 EBV-LMP2 多表位肽免疫原性，为 EBV 感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。 方法： 1.以 EBV 标准株(B95-8 细胞)LMP2 的完整氨基酸序列(497aa)为基础，应用在线预测网站 SYFPEITHI(http：/www.syfpeithi.de/)，预测 EBV-LMP2的 H2-Kd、HLA-A
48、*0201、HLA-A*2402、HLA-DRB1*0401、HLA-DRB1*0301、HLA-DR：B1*1501 等限制性表位，尤其是 HLA-A*0201、HLA-A*2402、H2-kd 重叠的区域，选择含 CTL、Th 表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的 EBV-LMP2 B细胞表位1，选择 B 细胞表位及 CTL、Th 细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。 2.将 EBV-LMP2 多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒 pET32a(+)，构建含有 His 标签的重组质粒 pET32a(+)/EBV-LMP2多表位肽。经 IPTG 诱导表达后的融合蛋白
49、进行 SDS-PAGE 蛋白电泳，并用Western blot 鉴定其免疫原性，用 Ni-NTA 树脂亲和层析法纯化融合蛋白 EBV-LMP2 多表位肽及 His 蛋白。 3.选择 68 周龄雌性 BALB/c 小鼠，分 3 组，即 EBV-LMP2 多表位肽组、His 蛋白组及 PBS 组，每组 9 只。将纯化后的融合蛋白 EBV LMP2 多表位肽及 His 蛋白与佐剂等体积混匀后按照 50g/只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后 1w 断尾取血并收集阴道分泌物，采用 ELISA 法检测血清中特异性 IgG 和阴道分泌物中特异性 sIgA 水平。同时，于术次免疫后 1w，每组随机取 3 只小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞进行 CTL 细胞特异性杀伤活性检测，采用乳酸脱氢酶LDH 释放
