1、儿科学专业优秀论文 Astrocyte elevated gene-1 在神经母细胞瘤中的表达及基因沉默对细胞生物学行为的影响关键词：神经母细胞瘤 RNA 干扰 基因沉默 细胞生物学摘要：第一部分: AEG-1 在神经母细胞瘤中的表达及其对预后的影响 1.目的: （1）检测 AEG-1 在神经母细胞瘤中的表达 （2）研究 AEG-1 的表达与神经母细胞瘤临床病理参数的关系及其对预后的影响 （3）明确 AEG-1 在神经母细胞瘤细胞中的定位 2.材料与方法: （1）收集病例资料：收集山东大学齐鲁医院接受手术并病理证实的神经母细胞瘤标本 32 例，详细记录病人的资料，并进行随访。 （2）研究 AE
2、G-1 在神经母细胞瘤组织的表达：免疫组织化学法。（3）明确 AEG-1 在神经母细胞瘤细胞中的定位：免疫荧光标记法。 3.结果: （1）AEG-1 在神经母细胞瘤组织中是高表达的，75（24/32 例）标本为阳性表达。 （2）对 32 例神经母细胞瘤患者的临床资料进行 x2 检验，研究AEG-1 与临床病理参数之间的关系。年龄lt;1 岁的患者中 AEG-1 阳性率为37.5（3/8） ，年龄1 岁患者中 AEG-1 阳性率为 87.5（21/24） ，二者相比有显著性差异（P=0.012） ，年龄1 岁组 AEG-1 表达水平高于年龄lt;1 岁组；男性患者中 AEG-1 阳性率为 77.
3、8（14/18） ，女性患者中 AEG-1 阳性率为71.4（10/14） ，二组无显著性差异（P=0.703） ；原发部位为肾上腺的患者中AEG-1 阳性率为 78.9（13/19） ，发病部位为肾上腺以外的患者中 AEG-1 阳性率为 69.2（11/13） ，二组无显著性差异（P=0.420） ；处于疾病早期（Early stage） （+s）的患者中 AEG-1 阳性率为 50（5/10） ，处于进展期（Advanced stage） （+）患者中 AEG-1 阳性率为 90（18/20） ，二组相比有显著性差异（p=0.03） ，进展期 AEG-1 表达水平高于早期；根据国际神经母细
4、胞瘤病理分型，组织结构良好型（Favourable histology，FH）的患者中 AEG-1 阳性率为 58.8（10/17） ，组织结构不良型（Unfavourable histology，UFH）患者中 AEG-1 阳性率为 93.3（14/15） ，二组相比有显著性差异（P=0.041） ，UFH 患者 AEG-1 表达水平高于 FH。 （3）Spearman 相关性分析，AEG-1 表达与患者的发病年龄（r=0.404，P=0.022） 、临床分期（r=0.447，P=0.010） 、病理分型（r=0.389，P=0.024）呈正相关。 （4）对32 例神经母细胞瘤患者进行单因素
5、 Kaplan-Meier 分析，再用 Log-rank 检验两组生存率的统计意义，研究与神经母细胞瘤预后相关的因素。 （5）Cox 多因素分析结果，国际神经母细胞瘤病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素（P=0.022） ；AEG-1 的表达（P=0.176） ，年龄（P=0.247） ，临床分期（P=0.694）不是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。 （6）AEG-1 在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达，在细胞核内没有 AEG-1 的表达。 4.结论: （1）AEG-1 在神经母细胞瘤组织中是高表达的，75（24/32 例）标本为阳性表达。 （2）AEG-1 的表达在不同的发病年龄
6、、临床分期、病理类型的患者之间有显著性差异，而在不同的性别、不同发病部位的患者之间没有显著性差异。（3）Spearman 相关性分析，AEG-1 表达与患者的发病年龄、临床分期、病理分型呈正相关。 （4）对 32 例神经母细胞瘤患者进行单因素 Kaplan-Meier 分析，再用 Log-rank 检验两组生存率的统计意义。AEG-1 的表达、病人的发病年龄、临床分期和病理分型对患者预后的影响具有统计学意义，而病人的性别和起病的部位对患者的预后没有影响。 （5）Cox 多因素分析结果，病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。 （6）AEG-1 在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达，在细胞核
7、内没有 AEG-1 的表达。 第二部分:慢病毒介导的神经母细胞瘤细胞 AEG-1 基因沉默 目的: （1）构建 AEG-1 RNA 干扰慢病毒载体 （2）筛选 AEG-1 基因沉默的细胞株 （3）比较 AEG-1 基因沉默的效果 材料与方法: （1）AEG-1 RNA 干扰慢病毒载体的构建：采用 Invitrogen 公司的 BLOCK-iTLentiviral RNAi Expression System，构建入门克隆和病毒包装目的质粒。 （2）RNA 干扰慢病毒的生产和滴度测定：四种质粒共转染 293FT的方式生产病毒，病毒功能滴度测定用转导试验，分子滴度测定用定量 PCR 技术。 （3）
8、基因沉默细胞株的筛选：慢病毒转导 M17 和 SK-N-SH 细胞后用Blasticidin 筛选，建立 AEG-1 基因沉默细胞株和对照细胞株。 （4）细胞瞬时转染实验：用 Lipofectamine2000 进行转染试验，评价 RNAi 效果。 （5）AEG-1 mRNA 表达水平的分析：定量 RT-PCR。 （6）AEG-1 蛋白表达水平的检测：Western Blot 分析。 3.结果: （1）成功构建 AEG-1RNAi 入门质粒，两个针对不同序列的 RNAi 质粒均有显著的干扰效果，AEG-1mRNA 抑制效果分别达 53.7和 61.1。 （2）包装产生的浓度为 21010cop
9、ies/ml 的 Lenti6-AEG-1 和 Lenti6-NS 转导 M17、SK-N-SH 细胞的功能滴度分别为：1.8106TU/ml、1.2106TU/ml 和 1.7106TU/ml、1.2106TU/ml。 （3）成功筛选出 AEG-1 基因沉默的 M17/AEG-1（-）和 SK-N-SH/AEG-1（-）细胞，同时建立非特异性对照细胞 M17/NS 和 SK-N-SH/NS。 （4）M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的 AEG-1mRNA 水平约下降 80，M17/NS 和 SK-N-SH/NS 的AEG-1mRNA 水平与亲本细胞相比无明显改变；M1
10、7/AEG-1（-）和 SK-N-SH/AEG-1（-）的 AEG-1 蛋白质水平约下降 90。 4.结论: （1）成功构建 AEG-1 shRNA 表达质粒，并比较针对不同靶序列的 RNAi 质粒的效果，确定 RNAi 效果较好的靶序列。 （2）采用 BLOCK-iT 慢病毒 RNA 干扰系统，成功构建并包装生产较高滴度的慢病毒载体。 （3）应用病毒转导加 Blasticidin 筛选的方式，成功建立 AEG-1 基因稳定沉默的 M17 和 SK-N-SH 细胞及非特异性病毒转导细胞。（4）定量 RT-PCR 和 Western Blot 分析结果表明筛选细胞 AEG-1 基因 mRNA水平
11、显著抑制，蛋白质水平明显下降。 第三部分:AEG-1 基因沉默对神经母细胞瘤的生物学行为的影响 1.目的: （1）观察 AEG-1 基因沉默对细胞增殖的影响 （2）分析 AEG-1 基因沉默对细胞周期的影响 （3）探讨 AEG-1 基因沉默对凋亡的影响 （4）研究 AEG-1 基因沉默对肿瘤细胞侵袭的影响 （5）分析 AEG-1 基因沉默对细胞化疗敏感性的影响 2.材料与方法: （1）细胞增殖实验：采用 MTT 法和克隆形成实验评价 AEG-1 基因沉默对细胞增殖的影响。 （2）细胞周期分析：用流式细胞技术测定细胞 DNA 含量，Modtif 软件分析细胞周期。 （3）细胞凋亡实验：采用 An
12、nexin-V 和 PI 双染流式细胞仪分析AEG-1 基因沉默对细胞的凋亡情况的影响。 （4）细胞侵袭能力实验：Transwell 侵袭试验。 （5）化疗敏感性实验：MTT 法测定细胞对化疗药物敏感性的差异。 3.结果: （1）AEG-1 基因沉默细胞增殖分别降低45.1，57.4，明显慢于亲本细胞，克隆形成率分别降低 43.5，56.7；非特异性对照转染的细胞增殖未受明显影响。 （2）AEG-1 基因沉默细胞G0/G1 期细胞增加 29.3，26.9，与亲本细胞相比有显著性差异。 （3）AEG-1 基因沉默细胞的凋亡率增加 7.5和 6.4。 （4）AEG-1 基因沉默的细胞穿过膜的能力降
13、低 56.8，50.0，明显低于亲本细胞和对照细胞（Plt;0.01） （5）AEG-1 基因沉默细胞对化疗药物的敏感性明显增加。4.结论: （1）AEG-1 能促进神经母细胞瘤细胞增殖和抑制凋亡。 （2）AEG-1 基因沉默可以通过将细胞阻滞在 G0/G1 期，抑制细胞增殖。 （3）AEG-1 能促进肿瘤细胞的侵袭。 （4）AEG-1 基因沉默可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。正文内容第一部分: AEG-1 在神经母细胞瘤中的表达及其对预后的影响 1.目的: （1）检测 AEG-1 在神经母细胞瘤中的表达 （2）研究 AEG-1 的表达与神经母细胞瘤临床病理参数的关系及其对预后的影响 （3
14、）明确 AEG-1 在神经母细胞瘤细胞中的定位 2.材料与方法: （1）收集病例资料：收集山东大学齐鲁医院接受手术并病理证实的神经母细胞瘤标本 32 例，详细记录病人的资料，并进行随访。 （2）研究 AEG-1 在神经母细胞瘤组织的表达：免疫组织化学法。 （3）明确 AEG-1 在神经母细胞瘤细胞中的定位：免疫荧光标记法。 3.结果: （1）AEG-1 在神经母细胞瘤组织中是高表达的，75（24/32 例）标本为阳性表达。 （2）对 32 例神经母细胞瘤患者的临床资料进行 x2 检验，研究 AEG-1与临床病理参数之间的关系。年龄lt;1 岁的患者中 AEG-1 阳性率为37.5（3/8） ，
15、年龄1 岁患者中 AEG-1 阳性率为 87.5（21/24） ，二者相比有显著性差异（P=0.012） ，年龄1 岁组 AEG-1 表达水平高于年龄lt;1 岁组；男性患者中 AEG-1 阳性率为 77.8（14/18） ，女性患者中 AEG-1 阳性率为71.4（10/14） ，二组无显著性差异（P=0.703） ；原发部位为肾上腺的患者中AEG-1 阳性率为 78.9（13/19） ，发病部位为肾上腺以外的患者中 AEG-1 阳性率为 69.2（11/13） ，二组无显著性差异（P=0.420） ；处于疾病早期（Early stage） （+s）的患者中 AEG-1 阳性率为 50（5/
16、10） ，处于进展期（Advanced stage） （+）患者中 AEG-1 阳性率为 90（18/20） ，二组相比有显著性差异（p=0.03） ，进展期 AEG-1 表达水平高于早期；根据国际神经母细胞瘤病理分型，组织结构良好型（Favourable histology，FH）的患者中 AEG-1 阳性率为 58.8（10/17） ，组织结构不良型（Unfavourable histology，UFH）患者中 AEG-1 阳性率为 93.3（14/15） ，二组相比有显著性差异（P=0.041） ，UFH 患者 AEG-1 表达水平高于 FH。 （3）Spearman 相关性分析，AEG
17、-1 表达与患者的发病年龄（r=0.404，P=0.022） 、临床分期（r=0.447，P=0.010） 、病理分型（r=0.389，P=0.024）呈正相关。 （4）对32 例神经母细胞瘤患者进行单因素 Kaplan-Meier 分析，再用 Log-rank 检验两组生存率的统计意义，研究与神经母细胞瘤预后相关的因素。 （5）Cox 多因素分析结果，国际神经母细胞瘤病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素（P=0.022） ；AEG-1 的表达（P=0.176） ，年龄（P=0.247） ，临床分期（P=0.694）不是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。 （6）AEG-1 在神经母细
18、胞瘤的细胞浆和细胞膜表达，在细胞核内没有 AEG-1 的表达。 4.结论: （1）AEG-1 在神经母细胞瘤组织中是高表达的，75（24/32 例）标本为阳性表达。 （2）AEG-1 的表达在不同的发病年龄、临床分期、病理类型的患者之间有显著性差异，而在不同的性别、不同发病部位的患者之间没有显著性差异。（3）Spearman 相关性分析，AEG-1 表达与患者的发病年龄、临床分期、病理分型呈正相关。 （4）对 32 例神经母细胞瘤患者进行单因素 Kaplan-Meier 分析，再用 Log-rank 检验两组生存率的统计意义。AEG-1 的表达、病人的发病年龄、临床分期和病理分型对患者预后的影
19、响具有统计学意义，而病人的性别和起病的部位对患者的预后没有影响。 （5）Cox 多因素分析结果，病理分型是影响神经母细胞瘤病人预后的独立因素。 （6）AEG-1 在神经母细胞瘤的细胞浆和细胞膜表达，在细胞核内没有 AEG-1 的表达。 第二部分:慢病毒介导的神经母细胞瘤细胞 AEG-1 基因沉默 目的: （1）构建 AEG-1 RNA 干扰慢病毒载体 （2）筛选 AEG-1 基因沉默的细胞株 （3）比较 AEG-1 基因沉默的效果 材料与方法: （1）AEG-1 RNA 干扰慢病毒载体的构建：采用 Invitrogen 公司的 BLOCK-iTLentiviral RNAi Expressio
20、n System，构建入门克隆和病毒包装目的质粒。 （2）RNA 干扰慢病毒的生产和滴度测定：四种质粒共转染 293FT的方式生产病毒，病毒功能滴度测定用转导试验，分子滴度测定用定量 PCR 技术。 （3）基因沉默细胞株的筛选：慢病毒转导 M17 和 SK-N-SH 细胞后用Blasticidin 筛选，建立 AEG-1 基因沉默细胞株和对照细胞株。 （4）细胞瞬时转染实验：用 Lipofectamine2000 进行转染试验，评价 RNAi 效果。 （5）AEG-1 mRNA 表达水平的分析：定量 RT-PCR。 （6）AEG-1 蛋白表达水平的检测：Western Blot 分析。 3.结
21、果: （1）成功构建 AEG-1RNAi 入门质粒，两个针对不同序列的 RNAi 质粒均有显著的干扰效果，AEG-1mRNA 抑制效果分别达 53.7和 61.1。 （2）包装产生的浓度为 21010copies/ml 的 Lenti6-AEG-1 和 Lenti6-NS 转导 M17、SK-N-SH 细胞的功能滴度分别为：1.8106TU/ml、1.2106TU/ml 和 1.7106TU/ml、1.2106TU/ml。 （3）成功筛选出 AEG-1 基因沉默的 M17/AEG-1（-）和 SK-N-SH/AEG-1（-）细胞，同时建立非特异性对照细胞 M17/NS 和 SK-N-SH/NS
22、。 （4）M17/AEG-1（-）和SK-N-SH/AEG-1（-）的 AEG-1mRNA 水平约下降 80，M17/NS 和 SK-N-SH/NS 的AEG-1mRNA 水平与亲本细胞相比无明显改变；M17/AEG-1（-）和 SK-N-SH/AEG-1（-）的 AEG-1 蛋白质水平约下降 90。 4.结论: （1）成功构建 AEG-1 shRNA 表达质粒，并比较针对不同靶序列的 RNAi 质粒的效果，确定 RNAi 效果较好的靶序列。 （2）采用 BLOCK-iT 慢病毒 RNA 干扰系统，成功构建并包装生产较高滴度的慢病毒载体。 （3）应用病毒转导加 Blasticidin 筛选的方
23、式，成功建立 AEG-1 基因稳定沉默的 M17 和 SK-N-SH 细胞及非特异性病毒转导细胞。（4）定量 RT-PCR 和 Western Blot 分析结果表明筛选细胞 AEG-1 基因 mRNA水平显著抑制，蛋白质水平明显下降。 第三部分:AEG-1 基因沉默对神经母细胞瘤的生物学行为的影响 1.目的: （1）观察 AEG-1 基因沉默对细胞增殖的影响 （2）分析 AEG-1 基因沉默对细胞周期的影响 （3）探讨 AEG-1 基因沉默对凋亡的影响 （4）研究 AEG-1 基因沉默对肿瘤细胞侵袭的影响 （5）分析 AEG-1 基因沉默对细胞化疗敏感性的影响 2.材料与方法: （1）细胞增
24、殖实验：采用 MTT 法和克隆形成实验评价 AEG-1 基因沉默对细胞增殖的影响。 （2）细胞周期分析：用流式细胞技术测定细胞 DNA 含量，Modtif 软件分析细胞周期。 （3）细胞凋亡实验：采用 Annexin-V 和 PI 双染流式细胞仪分析AEG-1 基因沉默对细胞的凋亡情况的影响。 （4）细胞侵袭能力实验：Transwell 侵袭试验。 （5）化疗敏感性实验：MTT 法测定细胞对化疗药物敏感性的差异。 3.结果: （1）AEG-1 基因沉默细胞增殖分别降低 45.特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为
25、http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c#x 刔 彟 2Z 皙笜?D 剧珞 H 鏋 Kx 時 k,褝仆? 稀?i 攸闥-) 荮vJ 釔絓|?殢 D 蘰厣?籶(柶胊?07 姻Rl 遜 ee 醳 B?苒?甊袝 t 弟l?%G 趓毘 N 蒖與叚繜羇坯嵎憛?U?Xd* 蛥?-.臟兄+鮶 m4嵸/E 厤U 閄 r塎偨匰忓tQL 綹 eb?抔搉 ok 怊 J?l?庮 蔘?唍*舶裤爞 K 誵Xr 蛈翏磾寚缳 nE 駔殞梕 壦 e 櫫蹴友搇6 碪近躍邀 8 顪?zFi?U 钮 嬧撯暼坻7/?W?3RQ 碚螅 T 憚磴炬 B- 垥 n 國 0fw 丮“eI?a揦(?7 鳁?H?弋睟栴?霽 N 濎嬄! 盯 鼴蝔 4sxr?溣?檝皞咃 hi#?攊(?v 擗谂馿鏤刊 x 偨棆鯍抰Lyy|y 箲丽膈淢 m7 汍衂法瀶?鴫 C?Q 貖 澔?wC(?9m.Ek?腅僼碓 靔 奲?D| 疑維 d袣箈 Q| 榉慓採紤婏(鞄-h-蜪7I冑?匨+蘮.-懸 6 鶚?蚧?铒鷈?叛牪?蹾 rR?*t? 檸?籕
