1、第九章 酶动力学,酶反应动力学,1、反应分子数 1个反应分子参加的反应称为单分子反应。 AP 2个分子参加的反应称为双分子反应。 A+BP+Q 3个反应分子同时反应的可能性很小,一、化学动力学基础,2、反应级数 单分子反应:一级反应 vdc/dtkc 双分子反应:二级反应 vdc/dtkc1c2 零级反应:凡反应速度与反应物浓度无关，而受其它因素影响的称零级反应，反应速率为一常数 vdc/dtk,反应进行的速率和反应机制,热力学关注反应进行方向、可能性和限度,提纲,一、影响酶促反应的因素二、米氏反应动力学米氏方程成立的前提米氏方程的推导米氏方程的解读和延伸米氏方程的双重性米氏方程的线性转换三、
2、 酶抑制剂作用的动力学可逆性抑制剂不可逆性抑制剂四、别构酶的动力学别构酶的性质S 形曲线和Hill 方程Hill 作图协同性的优点,影响酶促反应的因素,酶促反应速率和反应类型 酶反应速率与非酶促反应一样，一般都是以单位时间内，底物或产物浓度的变化值来表示。影响酶促反应速率的因素 影响酶促反应速率的主要因素包括：酶浓度、底物浓度、反应温度、反应介质的pH和离子强度以及有无抑制剂的存在等。,温度对反应速率的影响,最适温度,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。,温度升高,酶促反应速度加快。,pH对反应速率的影响,最适pH,pH的变化影响酶活性中心的解离情况。过酸过碱可使酶
3、失活。在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适 pH,底物浓度对酶反应速率的影响,1、底物浓度对酶促反应速率的影响,酶促反应的动力学方程,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。,反应速度达到最大值Vmax，再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。,底物浓度对酶促反应具有特殊的饱和现象。,酶浓度对反应速率的影响,Leonor Michaelis (1875-1949),Maud Menten (1879-1960),米氏反应动力学创始人,米氏反应动力学,酶反应动力学最简单的模型由Lenor Michaelis和Maude Menten于1913年提出，因此
4、又名为Michaelis-Menten模型或M-M模型。米氏方程推导设定的3个条件：反应速率为初速率，因为此时反应速率与酶浓度呈正比关系，避免了反应产物以及其它因素的干扰酶底物复合物处于稳态即ES浓度不发生变化符合质量作用定律,快速平衡法,2、米氏方程的推导,中间复合物学说,稳态理论,Briggs 修正之,稳态指反应进行一段时间后，ES,尽管S和P不断变化，但复合物ES的生成与分解速率相等，ES保持不变的这种反应状态为稳态即dES/dt0,在反应开始阶段，ES的生成速率只与S+EES（P+EES 忽略不计）有关 dES ES生成速率 =k1(E-ES).S dtEES表示未与底物结合的游离状态
5、的酶浓度当SE 被酶结合的S即ES占总S的极小部分，可忽略不计。SESS ES的分解速率 dES - =k2 ES+k3ES dt在稳态下，ES的生成与分解速率相等。 k1(E-ES).S=k2 ES+k3ES,k1 k3E+S ES E+P k2 k4,k1(E-ES).S=k2 ES+k3ES(E-ES).S k2 +k3 k2 +k3 = 令 =km ES k1 k1 ES-ESS=km.ES ES ES= km+S ES酶反应速率v与ES呈正比， v=k3ES= k3 km+S当反应体系中SE所有E几乎被底物所饱和，形成ES，即EES 酶促反应达到最大速率，Vmax k3ESk3E V
6、maxS V= km+S,Km 即为米氏常数，Vmax为最大反应速度,米 氏 方 程,米 氏 方 程,1). 当S km,3). 当S=km,V=1/2Vmax,在此条件下才能正确测定酶活力,米氏常数的单位为mol/L。,米氏方程的双重性,米氏方程与米氏常数,v =0.75 Vmax,已知某一酶促反应的Km，请求出在 S=3Km条件下反应速率 v与Vmax的比值。,解：,米氏常数 Km 的意义,不同的酶具有不同Km值，它是酶的一个重要的特征物理常数特性常数。,Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。,判断可逆反应方向和趋势，只有Km值
7、小的反应比较占优势。,Km值大 亲和力小,Km值表示酶与底物之间的亲和程度 （令Km=K2+K3/K1),Km值最小者称为该酶最适底物即天然底物。,Km值小 亲和力大,转换数（ kcat ） ：当酶被底物饱和时每秒钟每个 酶分子转换底物的分子数。 Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。,当酶被底物饱和时,酶催化效率,（kcat / Km ）,kcat/Km 上限：酶与底物在水溶液中扩散相遇所限制。,（扩散控制限制：108109MoL/LS ）,当S很大时， Vmax k3ES， Vmax与ES成线性关系，斜率为 k3 k3通称为催化常数（ Kcat ）。,几种酶的动力学参数,米氏方程的线性转换
8、,直接使用米氏方程中的v对S作图得到的是一条曲线，从图中虽然也能得到Km 值和Vmax值，然而，由于实验误差的客观存在，只要出现任何可见的误差使数据点偏离真实的位置，那么就很难画出一个很完美的曲线，但在同样的条件下，画直线更容易。因此，将米氏方程进行线性化处理就显得十分必要。,km和Vmax值的测定,双倒数法作图！,变形,纵轴交点：1/Vmax,横轴交点：1/Km,Eadie-Hofstee作图,Hanes-Wolff 作图,一个酶活性单位（1IU）： 在最适条件下，每分钟内催化1moL产物生成所需要的酶量,1开特（1 kat ）： 在最适条件下， 每秒钟催化一摩尔底物转变成产物所需的酶量。,
9、通过绘制酶反应进程曲线，确定初速率时间区间0-t1，在该区间内的酶促反应速率与酶量成正比 （酶活都是以反应初速率表示）,P,t,酶反应进程曲线,酶活的测定测定产物增加量/底物减少量 （最常用风光光度法）,斜率 =产物浓度/时间 =v（初速率）,t1,初速度对底物浓度应是 零 级反应，而对酶浓度应是 一 级反应。,酶活的测定,测定产物增加量/底物减少量,最常用风光光度法,氧化还原反应过程中辅酶还原态在340nm具有特殊光吸收特性,酶活力计算题,1、 10ml唾液，稀释20倍，取1ml测定淀粉酶活力，测知每5min水解淀粉产生2.5g还原糖,测定其稀释液中蛋白质含量为1mg/ml,计算唾液中淀粉酶
10、的总活力，比活力，转换数(S-1 )。酶活定义：在最适条件下每分钟水解淀粉生成1g葡萄糖的酶量称为1个活力单位。葡萄糖分子量180,淀粉酶分子量50000。,总活力=200 2.5/5=100 U比活力=2.5/51=0.5 U/mg转换数=(2.5/560180)/(1/5104+3) =12.5107 /54000=2314.8 (S-1 ),当酶被底物饱和时，每一催化中心在单位时间内所能转换底物分子的数量，即每摩尔酶活性中心在单位时间内转换底物的摩尔数（/S） 。 表征分子活性,酶的纯化运用各种蛋白纯化技术,离子交换层析,凝胶层析,亲和层析,纯化前,纯化后,目标蛋白,如何表示纯度,9、酶
11、的纯化运用各种蛋白纯化技术,每次纯化过程之后都要分别测保留物与舍弃部分的酶活与蛋白含量，以决定该纯化步骤的取舍。,酶的比活力：指每毫克蛋白质所具有的活性单位数，用“Umg蛋白质”表示。,纯度单位,纯化方法选择的标准：比酶活、回收率高！,细胞初提物,硫铵沉淀,离子交换层析,凝胶过滤层析,亲和层析,体积,总蛋白,活性,比活,某酶的初提取液经过一次纯化后，经测定得到下列数据：,初提取液,硫铵沉淀,比活力,回收率,纯化倍数,20,180,17%,9,酶抑制剂的类型可逆性抑制剂。以次级键与酶可逆结合，使用透析或超滤就可去除它们，让酶恢复活性；不可逆性抑制剂。也被称为酶灭活剂，以强的化学键（通常是共价键）
12、与酶不可逆结合，可导致酶有效浓度的降低，因此一旦失活就不可逆转。如果想恢复酶的活性，唯一的手段只能是补充新酶。酶抑制剂对米氏酶动力学性质的影响,酶抑制剂作用的动力学,可逆性抑制剂,可分为竞争性、非竞争性和反竞争性抑制剂。1. 竞争性抑制剂（1）性质：有两类，一类与底物在结构和化学上具有很强的相似 性；第二类与底物无结构和化学性质的相似性。（2）动力学： Km值提高，但Vmax不变。2. 非竞争性抑制剂（1）性质：既能与ES结合，又能与游离的酶结合。一旦它们与E结合，将导致酶活性受到抑制。（2）动力学：Km不变,Vmax降低。3. 反竞争性抑制剂（1）性质：只能与ES结合，但不能与游离的酶结合。
13、一旦它们与ES结合，将导致与活性中心结合的底物不再能够转变为产物。（2）动力学： Km降低,Vmax降低。,琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制,竞争性抑制剂,v,S,vmax,Km,1/S,1/v,1/vmax,-1/Km,斜率=Km/vmax,KI,Km 升高vmax 不变,+抑制剂,Km(1+I/KI),-1/(Km(1+I/KI),斜率= Km(1+I/KI)/vmax,非竞争性抑制剂,k1,k-1,k2,KI,Km 不变vmax 降低,KI,反竞争性抑制剂,k1,k-1,k2,Km 降低vmax 降低,+抑制剂,KI,1/S,1/v,1/vmax,-1/Km,斜率=Km/vmax,(1+ /(1
14、+I/KI)/Vmax,斜率= Km/vmax,v,S,vmax,Km,Km/(1+ I/KI),Vmax/(1+I/KI),- (1+ /(1+I/KI) /Km,不可逆性抑制剂,1. 基团特异性抑制剂 这类抑制剂在结构上与底物无相似之处，但能共价修饰酶活性中心上的必需侧链基团而导致酶活性不可逆的失活。由于许多氨基酸残基含有亲核侧链基团，所以充当基团特异性抑制剂的一般是亲电试剂。2. 底物类似物抑制剂 这类抑制剂在结构上相似于底物，因此在活性中心与酶结合，然后不可逆地修饰酶活性中心上的必需基团，导致酶活性的丧失。3.过渡态类似物抑制剂 这类抑制剂与酶促反应的过渡态极为相似，它们在化学结构和分
15、子形状上与酶的活性中心十分般配，能够以极高的亲和力与活性中心结合，从而导致底物无法进入而使得酶活性受到不可逆性抑制。4.自杀型抑制剂 这类抑制剂受酶本身的激活，在与酶结合以后，受到酶的催化发生几步反应，但并不形成产物，而是变成高度反应性的化合物后，转而修饰酶的必需基团导致酶活性的丧失。,乙酰胆碱酯酶的基团特异性抑制剂,TPCK对糜蛋白酶活性中心His的修饰,N,N-二甲基炔丙胺对单胺氧化酶的自杀型抑制,别构酶的动力学,一、别构酶的性质速率/底物浓度曲线为S型具有别构效应物对竞争性抑制的作用表现双相反应温和变性可导致别构效应的丧失通常是寡聚酶与非别构酶相比，别构酶占少数二、S型作图和Hill方程
16、,多底物酶促反应动力学,1、序列反应(Sequential reactions) 有序反应(Ordered reactions),随机反应 (Random reactions),多底物的酶促反应动力学十分复杂，米氏方程一般只适用于单底物反应,无顺序性,2、乒乓反应,2、乒乓反应,在所有底物加入之前，一种产物被释放的基团转移反应,双置换(取代)反应,稳定的酶形式,典型的别构酶催化的反应速率与底物浓度的S 型曲线,激活剂或抑制剂对别构酶活性的影响,S型曲线和Hill方程,既然米氏方程给出的是双曲线（v对S作图），所以它不适合具有底物协同性的呈S型曲线的别构酶，但Hill方程却能够很好地说明别构酶的
17、动力学，Hill方程是：Hill方程与米氏方程实际上十分相似，它们的主要差别首先是Hill方程中的底物浓度S被提高到h数量级，h被称为Hill系数；其次，方程底部的常数不是Km，而是K0.5，该常数也被提高了h数量级。K0.5与Km十分相似，因为它也是指速率为最大速率一半时候的底物浓度。Hill常数能够反映底物协同性的程度：如果h=1，这时的Hill方程实际上与米氏方程一模一样，这意味着酶不是别构酶，无底物协同性，速率对底物作图应该为双曲线，K0.5=Km；如果h 1，则速率对底物浓度作图呈S型曲线，酶具有正底物协同性；如果h 1，则意味着酶具负底物协同性。,Hill常数不同的酶反应速率与底物
18、浓度的关系曲线,Hill方程可以重新整理为：如果同时对两边取对数，就得：再以 对 作图，则得到斜率为h、纵截距为 、横截距为 的直线，这种作图法就是Hill作图法。,Hill作图,Hill作图,协同性的好处,1. 正协同性的优势 对于无协同性的米氏酶而言，将其反应速率从Vmax的 10% 增加到 90%时，需要较大的底物浓度增加。正协同效应意味着酶对环境中底物浓度的变化更为敏感。这样的结果可以使得机体内某些重要的调节酶能够根据环境的变化对代谢进行更加灵敏的调节。2. 负协同性的优势 呈现负协同效应的别构酶（h=0.5）要将其反应速率从Vmax的 10% 增加到 90%，需要将底物浓度提高6561倍。如此大幅度的提高就意味着该酶对底物浓度的变化极度不敏感。,Hill常数不同的酶的酶活性对底物浓度变化的敏感性,
