1、光学 DNA 生物传感器的种类及展望 王日晟 安徽理工大学 摘 要： 由于光学传感器具有非破坏性和高灵敏度的特点, 从而在生物传感器中有着广泛的应用。而随着对基因深入的研究和人类基因全序列的测序工作的顺利完成, 利用 DNA 为载体在生物监测方面的应用前景被十分看好。本文首先分析了光学DNA 生物传感器在生物传感器中的地位, 然后介绍了其研究特点。通过对光学DNA 生物传感器的基本原理和种类的介绍, 结合多学科交叉的特点, 对 DNA 生物传感器的发展前景进行了展望。关键词： 光学; DNA; 生物传感器; 光纤; 作者简介：王日晟 (1993-) , 男, 汉族, 安徽淮南人, 硕士研究生,
2、 DNA 计算与数据处理。1 引言生物传感器是一种多门学科相互交叉、互相渗透成长起来的高新技术装置, 其主要涉及生物、化学、物理、数学、电子技术等多种学科。生物传感器在国民经济的许多方面有着广泛的应用前景。特别是分子生物学与光电子学、微电子学、纳米技术等新学科、新技术结合, 正改变着传统医学、环境科学、动植物学等学科的面貌。对生物传感器的研究开发, 已成为国际科技发展的新热点, 成为当今新兴起的高技术产业的重要组成部分, 具有重要的战略意义。本文将重点研究光学 DNA 生物传感器。因为光学传感器具有非破坏性和高灵敏度的特点, 利用这些优点的光学的方法, 在生物传感器中有着广泛的应用。目前主要是
3、利用光波导技术及消失波原理进行光学 DNA 生物传感器的研究。光学DNA 生物传感器主要有光纤式、光渐消失波、表面等离子谐振 (共振) 式等类型。2 光纤 DNA 生物传感器光纤 DNA 生物传感器是将已知的核苷酸序列的单链 DNA 探针固定在毫米 (mm) 级的光导纤维的末端上1,2, 然后将若干条固定有单链 DNA 探针的光导纤维合成一束, 形成一个微阵列的传感器装置, 光纤的另一端耦合到荧光显微镜中, 测量时将固定有 DNA 探针的光纤一端浸入到荧光标记的目标 DNA 溶液中杂交, 来自荧光显微镜的激光通过光纤传导, 激发荧光标记物产生荧光, 产生的荧光信号仍经光纤返回到荧光显微镜中,
4、由 CCD 相机接收, 获得 DNA 杂交的图谱。光纤 DNA 传感器可检测杂交后产生的特异性信号, 其选择性强, 易于排除杂交过程中非特异性吸附干扰。Piunno 等1,31994 年首次在石英光纤表面连接长链脂肪酸分子, 脂肪酸分子末端连接上脱氧胸腺嘧啶衍生物, 然后在光纤上直接合成含 20 个胸腺嘧啶的寡核苷酸 (d T20) , 与杂交液中互补序列 (d A20) 杂交, 能检测 86ng/L 的核酸, 需时 46min。每增加 100g/L c DNA, 荧光强度增加 83%, 保存 3 个月和剧烈洗涤条件仍能维持活性。3 光渐消逝波 DNA 生物传感器光渐消逝波 DNA 传感器是近
5、年来发展很快的一种光学 DNA 生物传感器。其换能器实际上也是利用光纤传感器原理制作。当一束光线以适当的角度进入光纤时, 它会以全反射方式在光纤中传播, 产生一种横贯光纤的波, 通过光纤与其它介质的交接处传出光纤, 这种波随传播距离快速衰减, 我们称之为消失波。消失波光纤 DNA 生物传感器利用这种性质, 在消失波的波导表面上, 加上生物敏感膜 (单链 DNA 探针) , 当消失波穿过生物敏感膜时, 或产生光信号, 或导致消失波与光纤内传播光线的强度、相位或频率的改变, 测量这些变化, 即可获得生物敏感膜上变化的信息。Graham4在 1992 年, 建立了消失波光纤 DNA 生物传感器的一般
6、构建方法和检测方法, 对外界条件如溶液的 PH 值温度敏感膜在光纤的位置等对分析结果的影响进行了研究, 同时对固定在光纤上的寡核苷酸的长度及光纤上杂交的机理进行了研究。Strachan5在 1995 年, 建立了 PCR 与消失波光纤 DNA 生物传感器的偶联, 用消失波光纤 DNA 生物传感器检测 PCR 的产物。Abel5在 1996 年, 对消失波光纤 DNA 生物传感器的再生过程进行了研究, 他们发现杂交形成的双链能通过加热法或化学法解链, 一个消失波光纤 DNA 生物传感器可以重复使用数百次。Liu5在 1999 年, 制作了基于人工合成的分子灯塔探针的消失波光纤DNA 生物传感器,
7、 设计了两种生物素化的分子探针, 通过生物素-亲和素或生物素-抗生蛋白链菌素相互作用把探针固定在光纤表面。浓度检出限为1.1nmol/L。4 表面等离子体共振 (SPR) DNA 生物传感器表面等离子体共振 (SPR) 的基本原理是基于金属膜表面待测物质折射率的变化, 一般在棱镜上被覆盖一层金属银或金的薄膜, 与另一种折射率的介质相接触, 经 P 偏振处理的光线照射进入棱镜, 在金属-棱镜界面形成反射。在某一角度 (共振角) 测定时, 反射光强度最小。表面等离子体谐振对附着在金属表面的电介质的折射率非常敏感, 而折射率是所有材料的固有特征。因此, 任何附着在金属表面上的电介质均可被检测, 不同
8、电介质其表面等离子角不同。当金属膜表面固定的 DNA 单链探针与溶液中其相互补体结合时则会引起折射率的改变, 折射率上升, 从而导致谐振角改变, 用光波导将折射率的变化传输给检测器可进行检测6,7。它的检测方法有两种:一是 SPR 扫描, 是改变入射角度, 测定反射光强度与入射角的关系, 如 Bier8等, 以 avidin-biotin 法固定 DNA 探针, 通过比较发现在共振角处, 可配对的碱基个数越多, 共振信号就越强, 反射光强度则越小。另一种检测方法为 SPR 显微镜, 是将入射角固定在共振角附近, 用电荷祸合阵列检测器 (CCD) 检测反射光强与样品不同部位的关系。Com 等9研
9、究表明, 此方式可区分单双链 DNA, 并有可能进行突变识别。采用该原理制作的 DNA 生物传感器检测出灵敏度达 10fmol/mm, 响应时间小于 5min10。但是该方法的选择性较差, 难于排除非特异性吸附的干扰, 而且仪器的成本昂贵。5 荧光 DNA 生物传感器荧光 DNA 生物传感器是将 DNA 探针链进行荧光标记或与荧光物质相结合, 当探针与目标物质作用时荧光信号发生变化, 将识别信息转换为可检测的荧光信号, 实现对目标物质的定性、定量检测。荧光分析法具有用量少、选择性好、方法简便、灵敏度高、准确性好、可以原位、实时测定等优点。多种光学生物传感器都涉及荧光方法, 因此荧光 DNA 生
10、物传感器并非上述类型完全并列的另一种传感器。Yang 等11利用杂交分子探针技术在复杂的生物样品中实现对互补链的检测。这种检测方法不仅用于检测核酸、蛋白质等生物样品, 而且还可以用于细胞表抗原、细胞凋亡的检测等各种生化分析领域。Jin 研究小组12利用纳米金颗粒同时作为 DNA 的载体和荧光信号分子的猝灭剂, 建立了一种基于荧光共振能量转移进行 G-四链体小分子配体筛选的方法。Wang 等研究者基于共聚物与 DNA链之间的静电作用, 以及共聚物与荧光素之间的荧光共振能量转移, 建立了一种检测溶菌酶的荧光适体传感器13。Stanton 等14利用分子信标方法以及适体与凝血酶的特异性结合, 建立了
11、一种基于荧光共振能量转移和适体结构变化原理来检测凝血酶的方法。当存在 ATP 时, ATP 和适体特异结合, 适体构型发生变化, 带有猝灭基团的 DNA 链被释放出来, 荧光共振能量转移受到抑制从而使荧光信号增加15。Zhou 等16利用商业化有机染料 TOTO 与 DNA 核酸适体组成的复合物对蛋白成键前后荧光变化的敏感, 在生理条件下高选择性和高灵敏度地检测一种潜在的癌标记物癌蛋白 PDGF-BB。Stojanovic 和 Landry17设计了一种检测可卡因的生物传感器。6 光学 DNA 生物传感器展望DNA 生物传感器不仅可以识别特定碱基序列的 DNA, 还可以检测 DNA 的损伤情况
12、、DNA 中所含蛋白质种类和数量等, 而光学 DNA 生物传感器分子识别能力强, 可进行液相杂交检测, 在线和实时检测, 以及对活体内核酸动态进行检测。同时, 它还与目前的 DNA 生物芯片技术兼容, 在临床诊断、环境监测、药物筛选等方面都有广泛应用。如近年来, DNA 生物传感器因其简单、快捷、准确、灵敏的特点在监测环境中的基因诱变剂和病原微生物等方面受到广泛重视18。DNA生物传感器在监测环境中的病原微生物时选择被监测对象的特异性 DNA 片段为探针, 运用电化学或荧光指示剂, 检测 DNA 的杂交信号。随着生物化学和功能高分子材料的发展, 生物传感器将会向集成化、商品化的方向发展, 其在
13、市场上将会有更很好的应用前景。参考文献1Piunno P A, Krull U J, Hudson R H, et al.Fiber optic biosensor for fluorometric detection of DNA hybriditionJ.Anal Chim Acta, 1994, 288 (3) :205-214. 2Ferguson J A, Boles T C, Adams C P, et al.A fiber-optic DNA biosensor microarray for the analysis of gene expressionJ.Nat Biotech
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