1、第三节 原位杂交组织化学标本的制备 一、取材 用于原位杂交反应的组织应尽可能新鲜，这就要求取材迅速。由于很多RNA极易降解，因此取得的组织应尽可能迅速固定或冷冻。为了避免外援性RNA酶引起靶组织中RNA的丢失，取材时应戴手套，所用的器械、容器都要经高压消毒，或清洁后用经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的灭菌蒸馏水清洗。此外，要避免用含RNA酶很丰富的手直接接触组织、器械、容器和溶液等。,二、 固定 在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面，即保持良好的细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平及使探针易于进入细胞。,（一）固定剂 化学固定剂有沉淀固定剂和交联固定剂两类。常用的沉淀固定剂有乙
2、醇和丙酮等，经用沉淀固定剂固定的组织通透性较好，利于探针穿入组织。但沉淀固定剂可能引起RNA的丢失，而且组织的形态结构保存也不十分理想。,交联固定剂有多聚甲醛、戊二醛等。醛类交联固定剂可较好地保存组织中的RNA，对组织形态结构的保存也优于沉淀固定剂。但由于戊二醛这样的强交联固定剂固定后的组织通透性很低，探针较难进入其中。一般认为，4多聚甲醛对检测mRNA的组织固定较为理想，它既能有效地保存靶组织的形态结构，又可使组织具有一定的通透性。,（二）固定方法 先行灌注固定，然后取材并将取下的组织浸入固定液中再行浸渍固定。经固定和漂洗后的组织也可在15蔗糖磷酸缓冲液中于40C下保存12个月。新鲜组织也可
3、以在取材后直接以液氮或干冰速冻，冰冻切片后再浸入4多聚甲醛固定1030分钟，干燥后立即进行杂交或保存在-700C冰箱内。如果冰箱温度恒定，可保存数月之久。,三、 切片 在原位杂交中，以冰冻切片最常用。在切片时，要尽量避免RNA酶污染，操作时要戴手套，用70酒精或10SDS擦洗工作台、切片机刀架、摇柄和载物台等手常接触的部位以及其它器械。切片厚度可根据具体情况而定。如靶组织中待测mRNA的量较少，所采用的原位杂交技术敏感性较低，为了能得到较多的信号，切片可厚些（约1520m），反之，则可薄一些（约510m）。,如果细胞直接生长在载玻片或盖玻片上，则可将长有细胞的载玻片或盖玻片直接固定，再按上述方
4、法漂洗、干燥、储存。,第四节 杂交前处理 杂交前处理主要包括增强组织的通透性、减低背景染色两个方面。一、增强组织的通透性和核酸探针的通透性 增强组织通透性常用去污剂或某些消化酶处理，通过这种处理，可广泛地去除蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透性。,常用的去污剂是Triton-X100，一般都将切片浸入含0.20.5% Triton X-100的PBS内15min 。 蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十分重要。 蛋白酶K还具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。,二、 减低背景染色 （一）酸酐和稀酸处理 稀酸处理能使碱性蛋白变性，如再结合蛋白酶消化，即可将碱性蛋白移除，这样不仅能增
5、强靶核酸探针的可及性，也可避免碱性蛋白与核酸之间的非特异性结合，达到解降低背景的目的。,（二）预杂交 以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景染色的目的。（三）内源性生物素和酶的抑制 组织中内源性生物素、过氧化物酶或AKP则应事先阻断。 标本可用不标记的卵白素生物素孵育，以阻断内源性生物素。,适宜的杂交前蛋白酶消化有利于消除内源性生物素的干扰。 用5脱脂奶粉缓冲盐液来稀释标记的卵白素以及将标记标本浸于含2牛血清白蛋白的缓冲液，均可防止或抑制标记的卵白素与组织标本之间的非特异性结合。,第五节杂交反应 杂交液的成分与预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针。杂交前的准备只
6、是为杂交的成功奠定基础。,一、 双链DNA探针和靶DNA变性 进行杂交反应时，探针与靶核酸都必须是单链。 探针和靶核酸一旦变性，要马上进行杂交反应，否则，解链的核酸又会重新复性。 如果用单链探针检测靶RNA，一般不需变性。,微波炉处理不仅能使双链的探针和靶核酸有效地变性，而且还能使杂交信号增加。二、杂交液 杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较高浓度的盐、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及载体DNA和RNA等。Na+可使杂交率增加，还可减低探针与组织标本之间的静电结合。,甲酰胺可使Tm值降低； 硫酸葡聚糖能与水结合，从而减少杂交液的有效容积，提高探针有效浓度，以达到提高杂交率的目的。 牛血
7、清白蛋白及载体DNA或RNA等，都是为了阻断探针与组织结构成分之间的非特异性结合，以减低背景。,三、探针的长度 探针的最佳长度应在30100碱基之间。探针短，易于进入细胞，杂交率高，杂交时间短。四、探针的浓度 探针的浓度远比组织中靶核酸的浓度要高。一般为0.55.0g/ml，通常建议放射性同位素探针浓度为0.5g/ml，非放射性探针为2g/ml。,过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反而导致高背景染色等不良反应。五、杂交温度和时间 杂交温度应低于杂交体的融解或解链温度（Tm）2030,大约在3060之间,因为在这一温度条件下进行杂交反应,杂交率最高。一般常用的杂交温度为42左右。,杂交反应的时间可
8、能随探针浓度的增加而缩短,但在一个相当大的浓度范围内,杂交反应 6h内完成。在实际操作中,一般把杂交时间定为1620h,或为了工作方便,将杂交液和标本孵育过夜。然而,杂交时间不要超过24 h,反应时间过长,形成的杂交体会解链,杂交信号会减弱。,六、杂交严格度(hybridization stringercy) 错配对杂交体的稳定性较完全配对的杂交体的稳定性差。 影响严格度的因素有甲酰胺的浓度、杂交温度和高离子强度，因此可通过控制这些因素来减少非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。在低甲酰胺浓度、高离子强度和低杂交温度条件下，严格度低，反之严格度就高。,严格度越高，杂交反应的特异性越强，但敏感
9、性越低；反之，特异性越差，而敏感性越高。 在杂交时，将杂交液滴于组织切片上后，应加盖硅化的盖玻片，防止孵育过程的高温导致杂交液的蒸发，必要时可在盖玻片四周加橡皮泥封固盖玻片。,第六节 杂交后处理 杂交后处理的目的是除去未参与杂交体形成的过剩探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，包括与那些与靶核酸相似的序列与探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体，从而减低背景。,杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗。 洗涤的条件（盐浓度、温度、洗涤次数和时间）因核酸探针的类型和标记物的不同而略有差异，一般是盐浓度由高到低而温度由低到高。高浓度的盐可减少探针与组织标本之间静电结合，洗涤过程中
10、至少有一次高严格度条件（低盐、高温、高甲酰胺）下的漂洗。 漂洗过程中，还必须注意防止切片干燥，因干燥的切片即使用大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合。,第七节显示 显示又称检测，是指通过一定方法使杂交反应形成的杂交体（杂交信号）成为显微镜下肉眼可看见、识别的产物。对原位杂交反应的信号进行显示的方法因探针的标记物不同而已。,一、放射性同位素标记探针的显示 用32P、125I、35S等放射性同位素来标记探针，用放射自显影技术检测杂交信号。 放射自显影是利用感光乳胶记录被研究材料中放射性物质分布和定位的方法。在原位杂交中，放射自显影术的基本过程包括：组织切片中结合在探针上的放射性同位素以某种射线使感
11、光乳胶曝光后先形成潜影，再经显影、定影和水洗等程序后获得影像。,二、非放射性标记探针的显示 如果用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记探针，原位杂交信号可用相应底物的酶促反应来显示。 以地高辛标记的探针在进行原位杂交反应后，可根据免疫细胞化学原理，用结合有酶（如HRP或AKP）或荧光素的羊抗地高辛抗体与标记在探针上的地高辛进行免疫反应，再用相应底物显示酶促反应或以荧光显微镜产生荧光间接显示杂交体。,第八节对照试验 一般应在下述几种对照试验中选择34种以证实杂交结果的可靠性。一、 组织对照（一）Southern或Northern印迹反应,（二）免疫组织化学 如果能获得靶基因产物的抗体，可结合免疫组织化
12、学和原位杂交，从蛋白质（或多肽）水平和转录水平在相邻切片或同一切片中证明蛋白质（或多肽）和相应的mRNA共存于同一细胞中。,二、探针对照（一）已知阳性组织和已知阴性组织对照 阳性组织和已知不含靶核酸的阴性组织标本上进行原位杂交，应分别得到阳性结果和阴性结果。如果已知阳性组织出现阴性结果，则应对探针的制备及原位杂交的各个步骤进行检查。相反，如已知阴性组织出现阳性结果，则提示存在非特异性的杂交信号。,（二）用有意义链RNA探针做原位杂交 因为无意义链RNA的碱基序列与靶mRNA的碱基序列互补；用有意义链RNA探针进行原位杂交应得到阴性结果，这是证明探针特异性较好的阴性对照。,（三）吸收试验将无标记
13、探针先同特异性与之互补的DNA或RNA预杂交，然后再进行原位杂交，结果应为阴性。三、杂交反应对照（一）空白试验 在进行原位杂交时，将杂交液中省去标记探针，结果应为阴性。这是一项简便而有意义的阴性对照。,（二）杂交前用核酸酶预处理标本 根据靶核酸是DNA或RNA，对被检测的标本先用DNA酶或RNA酶进行预处理以消化被检测的核酸，然后再进行原位杂交。与未经DNA酶或RNA酶预处理的标本相比，如果杂交信号明显减弱，便证明标记探针与未经酶预处理标本中的DNA或RNA之间有杂交体形成。,四、显示系统对照（一）放射自显影显示系统对照 阳性对照是将浸渍乳胶的空白片在光线下曝光后显影，阳性结果证明乳胶及显影过
14、程工作正常。 阴性对照是将空白片浸乳胶后不经曝光便与原位杂交标本一起进行显影，结果应为阴性。如果阴性对照照片上有较多的银粒，则说明乳胶有放射性污染。,（二）非放射性原位杂交显示系统对照 绝大部分的非放射性原位杂交是以免疫组织化学方法进行显示的，在对照试验中应包括免疫组织化学的一系列阳性对照和阴性对照。具体对照试验的种类、操作方法与结果分析请参阅有关篇章或免疫组织化学专著。,第九节 原位杂交组织化学常用操作程序一、应用放射性同位素标记的寡核苷酸探针（一） 取材和切片1、 取材（1）新鲜组织速冻法：将动物麻醉后断头，迅速取材，并立即以干冰或液氮速冻1020min。（2）灌注固定法：将动物麻醉后，经
15、心脏先灌注温生理盐水，再以4甲醛0.1mol/L磷酸缓冲液（PB，pH 7.2）灌注固定，取材并浸于同样固定液中再固定24h，然后将取材浸入20蔗糖PB于40C冰箱过夜。,2、切片 将速冻的组织或灌注固定的组织在恒冷箱切片机中切片（厚1520m）。将切片贴于有粘胶剂的载玻片上，37或室温干燥以增加切片的粘附性。如不立即进行杂交处理，可将切片储藏于2080的环境中（可保存数月）。,（二）杂交前处理 1、4 多聚甲醛0.1mol/L,PB （pH 7.2）固定3060min（进 一步固定mRNA）； 2、0.1mol/L PB（pH 7.2）清洗3 次(每次5min)。（用磷酸缓冲 液冲洗）,3、
16、0.1mol/L,甘氨酸-0.1mol/L PB（pH 7.2）洗 5min。 4、0.3% Triton X-100 -0.1mol/L PB （pH 7.2）处理洗10-15min(室温)。 5、1g/ml蛋白酶K （pH 8.0的TB缓冲 液配制）消化30 min（37）。 （消化充分暴露）,6、4 多聚甲醛0.1mol/L,PB（pH 7.2） 终止消化和再固定（5min）。7、0.1mol/L,PB（pH 7.2）冲洗2次，每次3min。 8、0.25乙酸酐（以pH 8.0的0.1mol/L三 乙酸酐配制）处理10min。（碱性蛋 白乙酰化，去阳离子电荷）,9、4SSC 5min。（
17、从高浓度 低浓 度用标准枸椽酸盐洗掉乙酰酐） 10、2 SSC 10min。 11、70100梯度酒精脱水，每次3min。 12、氯仿脱脂10min后干燥。,i.杂交 1.配制杂交液： 在Eppendorf管中加入下列液体： 标记探针 0.11.0 106 cpm/载片 杂交缓冲 300 l/载片 2.将杂交液混匀后滴加在切片表面， 然后将载片放于密封塑料盒内杂 交2024h（4145）。,ii.杂交后冲洗1、4SSC 10sec2、1SSC 20min (37)3、0.5SSC 15min (37)4、70100% 梯度酒精脱水（每次 12 min），室温干燥。,iii.放射自显影1、在暗室
18、中将核乳胶在40水浴中溶解，然后把已杂交切片的载玻片浸入原液或以蒸馏水对比稀释的核乳胶液中，待几秒钟后慢慢地将载玻片提出，置于空气干燥2030min。然后将涂有乳胶的载玻片置于暗盒中，最后将暗盒于4下曝光14周。,2、以D19显影液将曝光的标本在20 下显影25min。3、水洗1 min。4、以F5定影液在20下定影25 min5、水洗30min。6、1硫瑾复染12 min。7、70100梯度酒精脱水，每次3 5min。8、二甲苯透明后，中性树胶封片。,a)应用地高辛标记的cRNA探针i.取材和切片 同“应用放射性同位素标记的寡核苷 酸探针”中（一）。 ii.杂交前处理 同“应用放射性同位素标
19、记的寡核苷 酸探针”中（二）中的“110”。,iii.杂交 1、杂交液配制：在杂交缓冲液中 加入适量的地高辛标记的 cRNA探针，使探针终浓度为 0.5ug/ml。2 、将混匀的杂交液加在切片上， 每片约 20 ul，4145保温 1224h。,iv.杂交后冲洗1、4SSC冲洗15min (37)。2、2SSC（含Rnase A,20 ug/ml） 冲洗10min (37)。 3、1SSC冲洗15min (37)。4、0.5SSC冲洗15min (37)。5、0.05 mol/L PBS (pH 7.2)冲洗3次， 每次5 min。,v.显示1、碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体 Fab片段（1：1000）室温下孵 育1h。 2、0.05 mol/L PBS (pH 7.2)冲洗 4次，每次5 min。 3、TSM2冲洗2次，每次5 min。 4、TSM2冲洗2次，每次5 min。 5、NBT和BCIP显色液中显色3h(室温 )。 6、0.05 mol/L PBS冲洗2次，每次5 min 7、脱水、透明、封片。,
