1、免疫组织化学和原位杂交技术,Immunohistochemistry (IHC) and In Situ Hybridization (ISH) 青岛大学医学院病理教研室 王 文 宏,第八章 核酸分子生物学基础 一、DNA变性 (denaturation) 指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构 的现象。变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间 的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。 凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热接近100、极端 的pH值(10或3)、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺 等，均可引起核酸分子变性。 变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变，如溶液 粘度
2、降低，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等。,一、DNA变性 (denaturation) DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收 260nm波长紫外光的特性。DNA双螺旋结构中碱基藏入 内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中 电子的相互作用更利于紫外吸收，故而产生增色效应 (hyperchromic effect)。 若以温度对紫外吸光率作图，典型DNA变性曲线呈S型， 可见DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。 通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值 50%时的温度称为核酸的解链温度，因这一现象和结晶的 融解相类似，又称融解温度(Tm, melti
3、ng temperature)。,融解温度 (Tm, melting temperature) DNA的均一性 均一DNA如病毒DNA，解链发生在很窄的Tm值范围； 不均一DNA如动物细胞DNA，其Tm值的范围较宽。 DNA分子中(G+C)的含量 一定条件下，DNA的Tm值由(G+C)碱基配对的含量决定。 DNA的Tm值的高低与其(G+C)的克分子含量呈直线关系。 溶剂的性质 低离子强度时，Tm值较低，反之则较高，因此DNA制剂 不应保存在离子强度过低的溶液中；pH值在5-9范围内， Tm值变化不明显，高pH值可使碱基失去形成氢键的能力， DNA完全变性；变性剂可干扰碱基堆砌力和氢键的形成，
4、因此可降低Tm值，如50的甲酰胺可使Tm值降低30。,二、DNA复性 (renaturation) 变性DNA只要消除变性条件，二条互补的单链可以 重新结合，恢复原来双螺旋结构，称为复性。 DNA变性后将温度慢慢冷却并维持在低于Tm25-30， 变性的DNA单链可恢复双螺旋结构，又叫退火。 复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA 热变后快速冷却，则不能复性。 DNA的变性和复性原理，现已在医学和生命科学上 得到广泛的应用，如核酸杂交与探针技术，聚合酶 链反应(polymerase chain reaction, PCR)技术等。,二、DNA复性 (renaturation) 1温度
5、温度过高，有利于DNA变性而不利于复性；温度过低， 不利于双键间随机形成的错配氢键的断裂，易造成两 条非互补单链间的非特异性结合。复性的适宜温度应 低于Tm值25左右。 复性时温度下降必须是一个缓慢过程，若在超过Tm的 温度下迅速冷却至低温(如4)，复性几乎不可能。 核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。 这说明降温时间太短以及温差大均不利于复性。,二、DNA复性 (renaturation) 2DNA的浓度：DNA浓度直接影响DNA单链间碰撞的几率。 DNA浓度越高，复性速度越快。3DNA片段的大小：大分子DNA扩散速度较慢，发现互补 的机会少，难以形成正确配对，因此复性较慢4
6、DNA分子的复杂性：当DNA总量一定时，基因组越复杂， 其中特定序列的拷贝数就越少，互补序列的浓度越低， 复性速度就越慢，而序列简单的DNA分子复性较快。5. 离子强度：溶液离子强度较高时，可有效中和DNA双链 间的磷酸基团的静电斥力，因此复性速度较快。,DNA的变性与复性,第九章 原位核酸分子杂交技术 原位杂交技术 (In situ hybridization，ISH) 是分子生物 学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术。 1969年美国耶鲁大学Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针 与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时1970 年Buongiorno-Nardelli等相继利用
7、同位素标记核酸探针 进行了细胞或组织的基因定位。 由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代 末到80年代初，因分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建 成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。,原位核酸分子杂交技术 原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有 互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸 (即探针)与组织、细胞或染色体上待测的DNA或RNA 互补配对，结合成特异的核酸杂交分子，经检测手段 将待测核酸定位显示。 原位杂交可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的 基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步 从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制，现已 成
8、为细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。 必须具备的重要条件：能与特定片段互补的核苷酸序列 (即探针)，有与探针结合的标记物。,核酸探针的种类来源和性质1、DNA探针 长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA，探针多为 某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列，且这些 DNA片段须是特异的，主要用于检测DNA和mRNA序列。 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽， 制备方法简便；DNA探针相对RNA而言不易降解，一般能 有效抑制DNA酶活性。 DNA探针的标记有多种方法，如缺口平移法，随机引物法 (量少且序列短易导致高背景着色)，同位素和非同位素标记。 缺点是易自身粘连，双
9、链DNA探针使用前需变性处理。,切口平移法是实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。利用E.coli DNA多聚酶I的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中从而形成高比活性的均匀标记的DNA探针。,核酸探针的种类-来源及性质2、单链cDNA探针 指互补于mRNA的DNA分子，是在逆转录酶作用下以RNA 的核苷酸顺序为模板，根据碱基配对的原则合成的DNA， 与一 般遗传信息流的方向相反，故称反向转录或逆转录。 由于cDNA中不存在内含子及高度重复序列，又克服了双链 cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，因此是一 种较为理想的探针。其标记方法同双链DNA探针。 优点是用前不
10、需要变性处理，不会因探针的自身粘连而造成 杂交液中探针的消耗，不形成大的链状连环使探针难于渗入 细胞内，从而提高与靶mRNA杂交反应的敏感性。,核酸探针的种类-来源及性质 3、单链RNA探针 探针和靶序列均为单链，所以它与靶序列的杂交反应效率 极高，比DNA-DNA杂交高几个数量级。 通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶来 控制RNA的转录方向，得到同义RNA探针(与mRNA同序列) 和反义RNA探针 (与mRNA互补)，又称cRNA。 单链 cRNA多用于检测mRNA的表达，一方面RNA-RNA杂交 体热稳定性好，探针大小比较稳定，杂交敏感性增强；另一 方面 cRNA探针不含载
11、体序列，可减少非特异性杂交， 杂交 后用RNA酶消化剩余的RNA探针，可降低非特异的背景着色。,核酸探针的种类-来源及性质4、寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是人工合成的与已知基因DNA互补的核苷酸 片段，长度多为30-50bp，可用DNA合成仪PCR扩增获得。 如仅知蛋白质的氨基酸排列顺序，可以按氨基酸的密码推导 出核苷酸序列，并用化学方法合成。 由于探针片段较短，常用化学或酶法在其DNA序列的两端 进行末端标记。 由于探针分子量小，浓度相对较高，杂交中更易进入细胞， 故所需时间较短，但信号放大作用较弱。,探针的标记物 探针的标记方式有放射性和非放射性标记，放射性标记物有 32P、3H、35S、1
12、4C、125I等，非放射性标记物有荧光素、 生物素和地高辛 (Dig) 等。 放射性同位素标记的探针敏感性高，但易造成放射性污染， 而且半衰期短、成本高、耗时长等，故使用受限。 非放射性探针的标记物虽敏感性不如放射性标记物，但性能 稳定、操作简便，成本低、耗时短等，日益得到广泛应用。 由于人类和多种动物组织标本内不存在类似地高辛的物质， 也是半抗原，因此可作为最佳的非放射性探针的标记物。,地高辛标记探针的原位杂交,原位杂交的方法 根据探针的标记物是否能够直接检测，原位杂交可分为 直接法和间接法两类。 直接法中探针用放射性核素、荧光素或酶标记，探针与 组织细胞内靶核酸形成杂交体，通过放射自显影、
13、荧光 显微镜或酶促呈色反应而直接显示。 直接法的操作简便省时，但缺乏对杂交信号的放大作用， 对一些低拷贝的靶序列检测的敏感性不够。 间接法多用半抗原标记探针，如地高辛、FITC或生物素， 最后通过免疫组化或组织化学的方法间接显示探针与组织 细胞内靶核酸所形成的杂交体，是最常用的原位杂交方法。,直接法原位杂交 间接法原位杂交,间接法原位杂交的基本步骤 杂交前难备：包括组织取材、固定、玻片的 处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景 染色等； 杂交； 杂交后清洗； 显示：包括放射自显影和非放射性标记的组织 化学或免疫组织化学显色。,杂交前准备-取材、固定 原位杂交反应的组织应尽可能新鲜，因RNA极
14、易降解， 组织应尽可能迅速固定或液氮冷冻。 为避免外源性RNA酶引起靶组织中RNA丢失，取材应戴 手套，所用的器械、容器都要经高压消毒，或清洁后 用DEPC(0.1%焦碳酸二乙酯)处理过的灭菌蒸馏水清洗。 尽快固定的目的是为保持细胞结构，最大限度地保存 细胞内DNA或RNA的水平，易与标记的探针结合。 4%多聚甲醛最常用，它不与蛋白产生广泛的交叉连接， 不会影响探针穿透组织和细胞。,杂交前准备-玻片和组织切片的处理1、玻片(载玻片和盖玻片)的处理 清洁液及95%乙醇浸泡24h后冲洗、烘干，烘箱温度最好 在150或以上过夜以去除任何RNA酶。 载玻片和盖玻片最好进行硅化处理，高温烘烤过夜，用 锡
15、箔纸包裹无尘存放备用。硅化玻片的优点是清洁无 杂质，光滑不产生气泡和影响组织切片与杂交液的 接触，盖玻片自身重量能使有限的杂交液均匀覆益。 将粘附剂涂抹在载玻片上，干燥后备用，以保证在整个 实验过程中切片不致脱落，常用多聚赖氨酸液和氨丙基 三乙氧基硅烷 (APES)。,杂交前准备-玻片和组织切片的处理2、增强组织通透性和核酸探针的穿透性 常应用稀释的酸洗涤、清洗剂Triton X-100或某些 消化酶，如蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。 广泛的去蛋白作用可增强组织的通透性和核酸探针 的穿透性，提高杂交信号，但同时也会减低RNA的 保存量及影响组织结构，用量及孵育时间应谨慎。 1g/ml的蛋白酶
16、K37孵育15-20min，能达到充分的 去蛋白作用(消化包围靶DNA的蛋白质)且不影响组织 形态；甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，可终止消化作用。,杂交前准备-玻片和组织切片的处理3、减低背景染色 杂交前用稀盐酸 (0.2mol/L) 处理10分钟，可使碱性 蛋白变性，再结合蛋白酶消化，可将碱性蛋白移除。 不仅能增强核酸探针的可及性，也可避免碱性蛋白与 核酸之间的非特异性结合达到降低背景的目的。 预杂交是指在杂交前用不含探针的预杂交液预先孵育 标本，以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的 位点，是减低背景染色的一种有效手段。 杂交后采用低浓度的RNA酶溶液(20g/ml)洗涤一次， 以减少残留的
17、内源性RNA，减低背景染色。,杂交前准备-玻片和组织切片的处理4、防止RNA酶的污染 由于在手指皮肤及实验玻璃皿上均可能有RNA酶， 整个杂交前处理过程都需带消毒手套。 石蜡标本切片时还需75%酒精擦洗工作台和切片刀， 展片需用高压消毒过的蒸馏水。 所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置 高温（240）烘烤以达到消除RNA酶的目的。 要破坏RNA酶，最低温度必须在150以上。,杂 交 (hybridization) 杂交是将已标记探针与待测标本上的靶核酸通过碱基 的互补配对结合形成杂交体的过程。 进行杂交反应时，探针和靶核酸都必须是单链，如用 双链DNA探针检测或待测靶核酸是DNA时，需进
18、行变性 处理才能使探针与靶核酸杂交。 杂交时将含有已标记探针的杂交液滴于切片组织上， 加盖硅化的盖玻片，在盖玻片周围加无菌的液体石蜡 封固防止孵育过程中杂交液的蒸发。 杂交温度应低于杂交体的解链温度(Tm)25左右，Tm 受G-C量、探针长短、杂交液中Na+和甲酰胺浓度的影 响，最佳杂交温度多数为37-42，孵育过夜。,杂交后清洗 包括系列不同浓度、不同温度盐溶液的漂洗，原则是 盐溶液浓度由高到低而温度由低到高，使不严格碱基 配对形成的杂交体解体，去除非特异性信号。 RNA探针杂交产生的背景染色特别高，但通过杂交后 RNA酶液的消化可除去附着组织上非碱基配对的RNA， 获得较好的反差效果。 漂
19、洗过程中切勿使切片干燥，否则很难减少非特异性 结合，从而增强了背景染色。,杂交体的显示 放射性同位素标记探针的原位杂交结果可用放射性 自显影来检测。 荧光杂交信号结果可直接在荧光显微镜下观察。 生物素、地高辛或FITC标记的探针原位杂交结果的 检测方法基本同免疫组化染色(HRP或AP显色)。 原位杂交结果显示后均可进行半定量测定，但必须 注意严格控制实验的同一条件，如切片厚度、核酸 保存量、温度控制等。,原位杂交的对照实验 原位杂交远较免疫组化染色复杂且影响因素多，所以必须 设立严格的对照实验，其设置须根据核酸探针和靶核苷酸 的种类和现有条件去选定。 组织对照1为证实原位杂交显示的核酸存在于被
20、检组织内，可从被检 组织中提取DNA或总RNA，用Southern或Northern印迹杂交 进行检测。若结果一致，两者互相支持；若阳性细胞比例 很小，杂交结果可能为阳性，而印迹反应则由于靶核酸的 含量太低而呈阴性。2如能获得靶基因产物的抗体，可结合免疫组化在相邻或同 一切片上证明蛋白质、多肽与相应mRNA共存于同一细胞中。,原位杂交的对照实验 探针对照1用探针在已知含靶核酸的阳性组织和已知不含靶核酸的 阴性组织标本上进行原位杂交，应得到阳性和阴性结果。 如果已知阳性组织出现阴性，则应对探针的制备及各个 步骤进行检查。如已知阴性组织出现阳性，则提示存在 非特异性杂交信号。2因有意义链RNA碱基
21、序列则与靶mRNA的序列相同，用其做 探针做原位杂交应得到阴性结果，可证明探针的特异性。3吸收实验是将标记探针先同与之互补的DNA或RNA杂交， 然后再进行原位杂交，结果应为阴性。,原位杂交的对照实验 杂交反应对照1空白实验是将杂交液中除去标记探针，结果应为阴性。 这是一项简便而有意义的阴性对照。2杂交前用DNA酶或RNA酶预处理标本，与未经核酸酶预处理 的标本相比，若杂交信号明显减弱，则证明标记探针与未 经酶预处理标本中的靶核酸之间有杂交体形成。3. 以核酸酶预处理标本并不能使杂交信号完全消失，要完全 消化靶DNA或RNA则需要对酶的浓度和消化时间等因素反复 摸索后才能实现。应注意在核酸酶处
22、理后，需把加在标本 上的酶清除干净，以免残留的酶破坏探针而导致错误结论。,原位杂交的对照实验 检测系统对照1放射自显影检测系统对照包括空白片的阳性对照(曝光)和 阴性对照(不曝光)。2绝大部分的非放射性原位杂交反应是以免疫组织化学方法 进行显示的，在对照实验中应包括免疫组织化学的一系列 阳性对照和阴性对照。 总结 实际工作中应根据具体情况选择三到四种对照试验，确保 原位杂交的有效性和特异性。,原位杂交的种类 根据所用探针的种类和靶核酸的不同，原位杂交分 为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。 因原位杂交多用于检测组织细胞内的mRNA及其表达， 故DNA-RNA杂交和
23、RNA-RNA杂交较多见。 DNA-DNA杂交用已标记的单链DNA为探针，同其互补 单链DNA发生的复性反应，根据互补碱基配对的程度， 来分析不同生物品种来源的两条或多条DNA链间彼此 关系密切程度，主要用于染色体原位杂交及对染色体 中的DNA进行定位。,原位DNA杂交-地高辛标记的DNA探针检测石蜡切片 1、组织切片的预处理(1) 固定: 10%中性福尔马林液固定组织，常规石蜡包埋，切片 厚4-6m，涂粘附剂，60烤片6-8h紧密粘贴。(2) 二甲苯脱蜡10min x2，高浓度至低浓度酒精各5min。(3) 入0.2mmol/L HCl 20min去除蛋白。(4) 50 2SSC (柠檬酸钠
24、缓冲液) 溶液中30min，内含5mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸-抑制依赖mg2+的核酸酶作用)。(5) 蛋白酶K (1g/ml溶于0.1 mol/L PBS中)，37 20-25 min。(6) 0.2 mol/L甘氨酸液室温10min，中止蛋白酶反应。(7) 4%多聚甲醛 (PBS新鲜配制)，室温20 min。(8) PBS含5mmol/L MgCl2漂洗10min2。(9) 脱水，从低浓度到高浓度至无水乙醇各3分钟，空气中干燥。,原位DNA杂交-地高辛标记的DNA探针检测石蜡切片2、预杂交 加预杂交液20l/每张切片，42水浴半小时(封闭 非特异性杂交位点，常用的封阻试剂有变性的
25、非特异 的鲑鱼精子或小牛胸腺DNA，大分子化合物如聚蔗糖、 聚乙烯吡咯烷酮、牛血清白蛋白、脱脂奶粉等)。3、杂交 加杂交液20l/每张切片，盖硅化盖片，将切片置于 95 10 min，使探针及待检DNA变性，双链解成单链， 然后迅速置于冰上1 min，再将切片置于盛有2SSC湿 盒内(Na+可中和DNA主链上的负电荷，利于结合探针)， 37-42过夜(16-18h)。有条件可采用原位杂交仪进行 变性和杂交。,原位DNA和DNA分子杂交 地高辛标记的DNA探针检测石蜡切片 碱性磷酸酶标记地高辛抗体-NBT/BCIP显色系统 终止显色，核固红/甲绿复染、脱水、透明、封片 结果 DNA杂交阳性信号的
26、胞核呈紫蓝色， 无DNA杂交阳性信号的胞核呈红色。,尖锐湿疣，地高辛标记的DNA探针检测HPV-DNA,RNA原位核酸杂交 RNA原位核酸杂交是运用标记的RNA或寡核苷酸等探针 检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。 用标记的已知RNA核苷酸片段，按碱基配对原则与待测 细胞或组织中的特异基因片段结合形成杂交体，显色后 在光镜或电镜下观察相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。 RNA原位杂交技术经不断改进，其应用领域已远超出DNA 原位杂交技术，在基因分析和诊断方面能作定性、定位 和定量分析，特别是针对低丰度和罕见mRNA的表达。,RNA与DNA原位杂交的主要区别点1、使用的探针不同
27、RNA原位杂交多采用RNA或寡核苷酸探针，可避免双链 DNA探针杂交中的复性和第二条链的竞争性杂交。 cRNA-RNA杂交体比DNA-DNA、cDNA-RNA性能稳定，杂交 后可用RNA酶液洗去未结合的探针，特异性更强。2、检测的目的不同 RNA原位杂交主要检测和分析内源性基因，包括细胞内 固有、异常和变异基因，其次为外源性基因。 DNA原位杂交主要检测外源性基因用作病原学诊断。3、有较高的灵敏度 RNA比DNA原位杂交能获得更好的低拷贝核苷酸的定位。,RNA原位杂交中探针的种类 RNA探针指已标记的能与组织内相对应的核苷酸序列 互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据来源可分 为特异性
28、cDNA、cRNA探针和人工合成寡核苷酸探针。1、单链cDNA探针 在逆转录酶作用下以RNA为模板，根据碱基配对的原则 合成的DNA，是与mRNA互补的DNA分子。 无内含子、其他高度重复序列及双链cDNA探针杂交复性 的缺点，所以提高了杂交反应的敏感性。 将cDNA导入M13衍生载体中可产生大量单链cDNA。这种 单链cDNA作探针不需要变性，使能与靶mRNA结合的探针 浓度提高，从而提高杂交反应敏感性。,RNA原位杂交中探针的种类2、cRNA探针 通过体外转录以cDNA为模板而获得的单链探针，没有 双链cDNA探针杂交复性的缺点。 体外转录反应物中可提供标记的核苷酸原料，因此能 得到直接标
29、记的cRNA探针。 cRNA-RNA杂交体比cDNA-RNA性能稳定且不受RNA酶影响， 因此杂交后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针，可 经受高严格洗涤从而大大降低背景着色。 cRNA探针的杂交饱和水平比双链DNA探针高，应用广泛。 cRNA探针的缺点制备过程较复杂，设备条件要求较高， 因对RNA酶敏感易受破坏，操作中要谨防RNA酶污染。,RNA原位杂交中探针的种类3、寡核苷酸探针 是以核苷酸为原料通过DNA合成仪人工合成的，可避免 真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。 多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性好。 根据目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。 因探针为脱氧
30、核糖核酸，对RNA酶不敏感，所以比RNA 探针更稳定；作为单链分子，杂交时不需加热解链。 缺点是与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定， 探针太长可造成内部错误杂交，太短可形成非特异性 结合，且携带标记物少导致信号放大和敏感性较低。,RNA原位杂交中探针的种类3、寡核苷酸探针的设计 确定寡核苷酸探针的序列能与靶核酸序列特异性结合。 如靶DNA或mRNA的序列已知，探针的序列按照碱基互补 原则很容易确定；如仅知氨基酸序列，因多数氨基酸 具有几种密码子，应选择简并性最小的氨基酸序列。 设计筛选寡核苷酸探针时应遵守以下一些原则：(1)长度多为3050bp，过长杂交时间长，过短特异性差。
31、(2)碱基中(GC)含量应在40-60，否则非特异性杂交多。(3)探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交 的“发夹”状结构。,RNA原位杂交中探针的标记 依标记物不同可分为同位素和非同位素标记两类。 同位素标记主要包括H3、C35、P32等，因其半衰期短、 性能不稳定、污染环境和危害健康等原因，在RNA原位 杂交中应用同位素标记的探针已日趋减少。 非同位素标记主要包括生物素、地高辛、碱性磷酸酶、 辣根过氧化物酶和荧光素。其中地高辛标记的cDNA、 cRNA和寡核苷酸探针，既具有生物素标记探针的优点， 又克服了组织内源性生物素的干扰，应用日益广泛。,新鲜标本的储存和冰冻切片制备 应严防
32、RNA酶的污染，制备过程中所用的容器、刀具等 均经高压消毒或清洁后用DEPC水清洗。 为防止RNA迅速降解，标本离体后先切成小块，其厚度 0.2cm，迅速投入4多聚甲醛置4冰箱内2-4h，再将 组织移入30蔗糖PBS溶液于4冰箱过夜。次日将标本 储存于-80或-140超低温冰箱内保存。 若做冰冻切片，先将组织在-20恒冷切片机内停留至 温度回升，修块后直接切成7m薄片，置40烤箱干燥 2h后储存在-80或-140超低温冰箱内备用。,标本的固定和石蜡切片的制备 应严防RNA酶的污染，容器、刀具等去除RNA酶的过程 同冰冻切片。 为防止RNA迅速降解，离体后标本应选用合适的固定剂 立即固定，常用的
33、有沉淀和交联固定剂。 沉淀固定剂为醇和酮类，固定后组织通透性较好，利于 探针穿入，但过长可引起RNA降解和组织形态改变。 交联固定剂为醛类(4%多聚甲醛)，能较好保存组织中的 RNA和组织形态结构，但过长大分子化合物可形成交联， 影响探针穿透力，阻碍杂交体形成。,原位杂交RNA探针的选择 RNA探针以50-150bp为佳，容易进入细胞，杂交率高且 杂交时间短。500bp的探针杂交时间约20h，超过500bp 的探针应在杂交前用有限碱基水解法控制长度。 杂交反应中探针浓度应超过靶序列的浓度，因为背景 着色度与探针浓度有关，必须给予最大信噪比。 最佳探针的浓度是达到与靶核酸的最大饱和结合度为 目的，因探针种类而略有不同，放射性标记cRNA探针 浓度为0.5ng/l，而非放射性标记为1.0 ng/l。 杂交液的量要适当，每张切片以30-50l为宜。为保持 不流失，玻片的清洁处理必须彻底并使用杂交罩等。,脊髓前角运动神经元内bcl-2 mRNA水平的表达,胃癌 HPV 16 E6 mRNA水平的表达,食道癌 HPV 16 E6 mRNA水平的表达,
