1、第四章 原位杂交组织化学,原位杂交组织化学简称原位杂交（in situ hybridization）,它是应用已知碱基序列并带有标记物的核酸探针与组织细胞中待测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的显示或检测系统，通过组织化学或免疫细胞化学等方法在核酸原有的位置进行细胞内核酸（DNA、RNA）定位。,第一节 原位杂交组织化学的分子 生物学基础 一、 核酸的分子结构,表1：核酸的化学组成 DNA RNA嘌呤碱 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G) 腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)嘧啶碱 胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T) 胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)戊糖 脱氧核糖 核糖 酸 磷酸 磷
2、酸,一） 核酸的化学组成,二）核酸的一级结构 指核酸分子中碱基的排列顺序。三）核酸的高级结构 核酸的多核苷酸链在次级键的基础上， 还可形成更为复杂的高级结构，即二级结构和三级结构。,染色体,（一） DNA的高级结构1、DNA的二级结构 双螺旋结构（由两条单核苷酸链组成）,DNA双螺旋结构要点,DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘旋，螺旋直径为2nm , 形成大沟及小沟相间。,碱基垂直螺旋轴居双螺旋内侧，与对侧碱基形成氢键共处于平面配对。（互补配对形式：A = T G C）,相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距
3、3.4nm，一圈10对碱基。,氢键维持双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性。,2. DNA的三级结构 闭合环状，天然状态的DNA分子多扭曲形成麻花状，以组蛋白为核心盘绕形成核小体等。（二）RNA的高级结构 原核生物和真核生物的RNA都是单链的，RNA单链的局部可发生发夹样回折，即局部折叠成的某一片段的A与G分别与另一片段的U和C配对，这种RNA单链局部小双螺旋结构即是RNA的二级结构。 有的RNA尚可形成三级结构，形成倒L型的三级结构。,二、 核酸的特性一）DNA的变性与复性 （一）DNA的变性与复性 DNA 双螺旋解开，导致空间结构的破坏，使有规则的 DNA变成不规则的线团，因而发生
4、性质改变，称为DNA变性。 变性的DNA是单链的。 加热接近1000C时，改变pH(10或3） 以及某些化学试剂（如乙酸、尿素、酰胺等）的作用，均可使DNA变性。,把50DNA分子发生变性的温度称为变性温度或融解温度（Tm）。（1）DNA的均一性：病毒DNA，解链发生在很窄的Tm值范围，动物细胞DNA其Tm值的范围较宽。（2）DNA分子中（GC）的含量：（二）DNA的复性 变性的DNA只要消除变性条件，两条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程成为复性。变性后的单链DNA即可恢复双螺旋结构，因此复性过程又叫作退火。,DNA变性的本质是氢键的断裂,复性的适宜温度一般低于Tm值250
5、C 左右。温度过高如接近变性温度，复性则难以进行；温度过低，不利于双链间形成随机形成的错配氢键的断裂，易造成两条非互补单链间的非特异性结合。倘若DNA热变性后快速冷却，则不能复性。,二）二） RNA的功能 根据结构和功能的不同， RNA可分为三类：即信使（mRNA）、转移RNA（tRNA）和核糖体RNA（ rRNA）。 （一）mRNA mRNA是以DNA为模板，合成后的mRNA经核孔进入细胞质，并与核糖体结合，将单核糖体连成多核糖体。,（一 （二） tRNA 在 tRNA分子中有能识别mRNA所携带的遗传密码的反密码子。tRNA 作为一种运载工具能把各种氨基酸搬运到多核糖体。( （三） rRN
6、A 核糖体是氨基酸装配的场所。,三）遗传信息的传递 DNA 一方面通过自身的复制传给子代细胞，另一方面，通过转录传递给mRNA ，再通过翻译使遗传信息在合成的蛋白质中得到表达，从而决定细胞的结构和特征。,（一）DNA 的复制 DNA双螺旋结构中两条多核苷酸链之间的氢键断裂，形成两条单链。然后以每条单链作为模板合成一条新的互补链，生成的两个新的 DNA分子分配到两个子细胞中。由于DNA复制后形成的新的DNA分子中有一半是保留的亲代DNA ，所以这种复制方式称半保留复制。,（二） 转录 遗传信息从DNA向RNA的传递过程称为转录 转录也是一种酶促的核苷酸聚合过程，转录只发生在一部分基因，复制则发生
7、在整条链； 这条指导转录的链称为有意义的链，另一条与有意义链互补的链称为反意义链或无意义链； 而复制是对称的，DNA两条链均作为模板进行复制，,转录的原料为核糖核苷酸，转录的产物为mRNA，tRNA、rRNA， 复制的原料为脱氧核糖核苷酸, 复制的产物为DNA。 RNA也可作为合成DNA 的模板，使这种以RNA 为模板合成DNA 的过程称为逆转录，逆转录形成的DNA称为互补DNA （cDNA），以单链cDNA 作为模板可合成双链DNA。,（一）翻译 mRNA中的遗传信息通过指导蛋白质合成而传递到蛋白质分子中的过程称为翻译。 tRNA 分子上有三个连续的核苷酸，称为反密码子，不同的tRNA能与特
8、定的氨基酸结合,氨基酸便按照 mRNA 分子上密码顺序排列起来,互相以肽键连接,最后形成蛋白质。,DNA携带的遗传信息通过转录传递给 mRNA ，mRNA 再通过翻译而传递到DNA分子指导下合成的蛋白质分子中，这一过程即基因表达过程。,第二节 核酸分子杂交概述 核酸分子杂交，简称分子杂交（molecular hybridization）,是指一定条件下，两条来源不同按其碱基互补的配对原则通过氢键形成杂合（异质）双链的过程，这是一项利用DNA变性复性原理而设计的极其重要的分子生物学技术。（DNADNA杂交）（RNARNA杂）（DNARNA杂交）。,应先将双链DNA分子通过变性解聚成单链后再进行杂
9、交。 单链核酸分子则不需变性即可直接进行杂交。 杂交双链即杂交体的稳定程度与它的变性或熔解温度（Tm）有关，Tm 值越高，杂交体越稳定。影响杂交体Tm值的因素主要包括以下几个方面：,（1）杂交双链的碱基组成：GC之间有三个氢键，AT之间或AU之间有两个氢键，故（GC）含量越高的杂交双链Tm值越高。（2）杂交双链的长度：杂交双链越长，Tm值越高。（3）杂交双链的碱基错配程度：错配的碱基越多，即错配的程度越高，Tm值越低。（4）溶液中的离子强度：离子强度越高，Tm值越高。（5）变性剂（如甲酰胺）的浓度：甲酰胺，以降低杂交反应的温度。,一、 核酸探针核酸探针是指已知碱基序列的核酸片段，并与待测组织的
10、核酸片段特异性结合（碱基互补）。一）核酸探针的种类根据核酸性质的不同，核酸探针可分为DNA探针、cDNA探针、RNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类。DNA探针和cDNA还有单链和双链之分。其中用于组织细胞内DNA或RNA定位检测的探针主要有单链cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针。,（一）cDNA探针 cDNA是互补于mRNA的DNA分子。 通过选择不同的载体来控制所产生的 cDNA是双链还是单链。如果以质粒作载体，则产生双链cDNA，获得的探针也是双链。 双链cDNA探针的检测灵敏度较低，较少用来做探测细胞内mRNA 的原位杂交反应。,如果将cDNA导入M13衍生载体中，则可产生
11、大量的单链 cDNA。 用这种单链 cDNA作探针,从而提高了杂交反应敏感性。（二）cRNA探针 cRNA探针是以DNA为模板在体外转录而成的探针。 以cRNA探针进行杂交反应可避免应用双链cDNA探针作杂交反应时存在的两条链之间的复性问题。,cRNA和mRNA之间形成的杂交体要比 cDNAmRNA杂交体稳定，因为杂交反应后可经受高严格度洗涤。cRNAmRNA杂交体不受RNA酶的影响，故杂交后还可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。此外，用体外转录合成的cRNA探针的长度比较一致。,cRNA探针的制备过程较复杂，需要较高的分子生物学实验条件，cRNA对RNA酶敏感，易被RNA酶破坏，因而在操作
12、过程中需要严格防止RNA酶污染。,（三）寡核苷酸探针 寡核苷酸探针是指化学合成技术在体外合成的，一般含1050个核苷酸的探针。寡核苷酸探针目前均由DNA合成仪合成。 在设计筛选寡核苷酸探针时应遵守以下一些原则： （1）长度一般为1850个核苷酸，过长者，杂交时间较长，合成量低，过短者，特异性较差。,（2）碱基中（GC）含量应在4060范围以内，超出此范围则会增加非特异性杂交。（3）探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。（4）避免单一碱基重复出现过多，不能多于4个，如不能出现CCCCC。,（4）杂交时间短：由于寡核苷酸链短，其序列较简单.（5）特异性强（6）使用简便：
13、合成的寡核苷酸探针性质上是脱氧核糖核酸，所以对RNA酶不敏感，因此比RNA探针更稳定;杂交时不需预先加热解链。,寡核苷酸探针也有一定缺点，如与mRNA的杂交不如RNARNA杂交稳定，再则，因其分子较短，结合的标记物较少，故其敏感性较低。,二）核酸探针标记的基本原理 利用核酸探针来检测相应的核酸，必须对探针进行标记，理想的探针标记物应具备以下几个条件： 首先，标记后的探针分子结构要尽可能与原来的分子结构相同；第二，标记探针的显示或检测要简便、节时、准确、可靠、重复性好；,第三，应安全无害。目前用于标记原位杂交探针的标记物有20多种，可分为放射性标记物（同位素）和非放射性标记物。常用的同位素有32
14、P、35S。 用所标记的探针进行的原位杂交反应,可用敏感性高的放射自显影技术检测. 但放射性同位素存在辐射危害和有半衰期限制，且放射自显影检测时间长。,合成的寡核苷酸探针与cDNA探针具有以下优点： （1）制备简易：寡核苷酸探针以核苷酸为原料，通过DNA合成仪短时间内即可合成，方法简便. （2）序列任定：可按照已知的某一特定目的或靶基因的核苷酸顺序合成任何一段特异性核苷酸序列用作探针。 （3）易穿透组织：由于寡核苷酸链不长，而且是单链。,非放射性标记物主要有以下几类：酶类，如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AKP）等；半抗原，如地高辛、生物素等；荧光素，如异硫氰酸荧光素等。 非放射性标记
15、物标记的探针虽然在敏感性方面不如放射性同位素标记探针，但其稳定性和分辨力高，而且检测所需的时间短，一般在24h即可得到结果；再者，操作简便，不存在放射性污染的安全问题，不需特殊的防护设备。因此，非放射性标记物的应用日趋广泛。,1、 放射性同位素标记i.缺口平移（Nick translation）法 缺口平移法是一种最常用的标记DNA的方法，通过DNA聚合酶I的催化作用，核苷酸加在3羟基上，同时，DNA聚合酶I还具有5 3方向外切酶活性，因此可将缺口处5端核苷酸依次切除。,1、,其结果是在缺口的5侧，核苷酸不断被水解，而在3端核苷酸依次被添加上去，从而使缺口沿着互补DNA链移动，原料中含有放射性
16、同位素（32PdATP）的核苷酸因此替代原DNA分子上的部分核苷酸而掺入到新合成的DNA链中，从而获得放射性标记的DNA探针。,ii.随机引物延伸（Random primer extension）法 随机引物延伸法是从单链DNA或RNA合成高比例活性的放射性同位素（如32P）标记探针所选用的方法。其原理是使被称为随机引物(primer)的长68个核苷酸的寡核苷酸片断，与变性的DNA或RNA模板随机互补结合（退火）。,iii.末端标记（End-labelling）法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的 3末端或5末端的一类标记法。可分为3末端标记法、5末端标记法和T4聚合酶替代法。,用
17、末端标记法制备的探针，携带的标记分子较少。3端和5端标记效率不同，3端标记效率高，但杂交敏感性低，5标记效率低，但杂交敏感性高。 末端标记法适用于寡核苷酸探针或短的DNA和RNA探针的标记。,iV.体外转录（In vitro transcription）法 在以体外转录方式合成cRNA探针时，如在转录体系中加入放射性同位素标记的三磷酸核苷原料，而标记的cRNA则能耐受DNA酶I的影响。,2.非放射性标记根据原理可分为酶促反应标记和化学标记两大类。i.酶促反应标记通过前述的缺口平移法、随机引物延伸法、末端标记法和体外转录法等标记方法对探针进行标记。常用的生物素、地高辛、荧光素等非放射性标记物均可如此标记探针。,ii.化学标记 化学标记是将不同标记物用化学方法连接到核酸探针分子上，方法简单，成本低。如光敏生物素标记法，其基本原理是先将一个光敏基团连接在生物素分子上，制得光敏生物素。光敏生物素在可见光照射下，即与核酸内的碱基间发生光化学反应而形成牢固的连接。地高辛也可以用类似方法标记核酸探针。,
