1、思考题,1.缺血再灌注损伤氧自由基生成增多的机制是什么？2.缺血再灌注损伤钙超载的机制是什么？3.缺血再灌注损伤对机体有利还是有害？4.组织缺血后在再灌注时应注意什么问题？,缺血-再灌注损伤 (Ischemia-reperfusion injury),Department of Pathology, Shanghai University of TCM,简介 (Introduction),1955年，Sewell结扎狗冠状动脉后，发现如突然解除结扎恢复血流，动物室颤而死亡。1960年，Jennings第一次提出心肌再灌注损伤的概念。1981年，Greenberg等证实猫小肠缺血3小时后再灌注时
2、，粘膜损伤更严重。,简介 (Introduction),休克、DIC微循环再通溶栓疗法动脉搭桥术体外循环后心肺复苏断肢再植、器官移植等血供恢复后,临床发现,定义 (Definition),缺血再灌注损伤 (ischemia-reperfusion injury) ：在缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重的现象。缺血再灌注损伤具有器官普遍性。,缺血再灌注损伤 缺血再灌注,原因 (Cause): 组织器官缺血基础上的血液再灌注。全身循环障碍后恢复血供：如休克微血管痉挛解除后、心脏骤停后心脑肺复苏等。组织器官缺血后血液恢复：断肢再植，器官移植。血管再通后：冠脉搭桥术，PTCA，溶栓疗法等。
3、,第一节:缺血再灌注损伤的原因及条件,再灌注时损伤是必然结果吗?,影响条件 (Conditions)缺血时间侧支循环 需氧程度 再灌注条件,缺血时间对大鼠再灌注心律失常的影响,自由基的作用 钙超载 微血管损伤和白细胞的作用,第二节:缺血再灌注损伤的发生机制,自由基：外层轨道上具有单个不配对电子的原子、原子团和分子的总称。类型： 1. 氧自由基： O2 OH 2. 脂性自由基：LO LOO 3. 其它：Cl CH3 NO (ONOO-)作用：生理情况下，自由基主要参与体内的电子转移，杀菌和物质代谢。,自由基 (free radical),自由基的产生 (source), 线粒体： 自由基生成的主
4、要场所之一。 自然氧化：Hb、Mb、CA等自然氧化过程中生成。 酶催化：体内存在的黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶等。 毒物作用： CCl4、百草枯（除草剂）等。,氮自由基,一氧化氮（nitric ocide, NO） cNOS O2 NOS：iNOS eNOSL-精氨酸 L-胍氨酸 +NO NADPH NADP+ 过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite, ONOO- ),体内羟自由基的主要生成途径,Haber-weise 反应及Fenton型Haber-weise反应O2 + H2O2 O2 + OH + OH- Haber-weise 反应 O2 + H2O2 Fe2+ O2 + OH + O
5、H- Fenton型Haber-weise 反应射线作用H2O X或射线 H2O+ （带正电水） H2O* （激发态水） H2O X或射线 OH- + H+ H2O 均裂 OH + H,Vit C、谷胱甘肽、辅酶Q,Vit E、胡萝卜素,自由基的清除 (elimination),1) 低分子清除剂,2) 酶性清除剂,自由基的清除 (elimination),过氧化氢酶(CAT),过氧化物酶,超氧化物歧化酶,MnSOD,CuZnSOD,生理情况下，自由基的生成与清除处于动态平衡。,自由基的平衡 (equilibrium),病理情况下，如果自由基生成过多或机体抗氧化能力不足，可引发氧化应激(oxi
6、dative stress)，导致细胞损伤。,自由基的平衡 (equilibrium),黄嘌呤氧化酶形成增多 中性粒细胞激活线粒体内氧单电子还原增多儿茶酚胺氧化增加,缺血再灌注时氧自由基增多的机制,黄嘌呤脱氢酶(XD) 90% 黄嘌呤氧化酶(XO) 10% XD xanthine dehydrogenase XO xanthine oxidase,(1) 黄嘌呤氧化酶途径（血管内皮源性）,Ca2+依赖性蛋白酶,缺血缺氧,ATP分解、耗竭,次黄嘌呤大量堆积,(+) 钙依赖性蛋白酶,离子转运功能障碍,XD XO,ADP、AMP含量升高,胞浆Ca2+,黄嘌呤氧化酶形成增多 中性粒细胞激活：缺血激活补
7、体，使细胞膜分解产生多种趋化物质，如补体片段、白三烯等，吸引并激活中性粒细胞。再灌注时，组织重新获得氧供应，激活的中性粒细胞耗氧量增加，产生大量氧自由基，称为呼吸爆发（respiratory burst）或氧爆发(oxygen burst)，造成细胞损伤。,缺血再灌注时氧自由基增多的机制,黄嘌呤氧化酶形成增多 中性粒细胞激活线粒体内氧单电子还原增多：缺血缺氧时，线粒体氧化磷酸化功能受损，氧单电子还原增多；同时，Ca2+超载可损伤线粒体功能，抑制细胞色素氧化酶系统，也会使活性氧的产生增多。儿茶酚胺氧化增加：单胺氧化酶,缺血再灌注时氧自由基增多的机制,氧自由基的损伤作用, 膜脂质过氧化增强 破坏膜
8、的正常结构，使膜的液态性、流动性降低，通透性增加；脂自由基导致离子通道功能障碍、细胞信号转导功能障碍；促进自由基及其它生物活性物质生成；导致线粒体功能抑制，ATP生成减少。, 抑制蛋白质功能,氧自由基的损伤作用, 破坏核酸及染色体自由基可使碱基羟化或DNA断裂，从而引起染色体畸变或细胞死亡。这种作用80%为OH. 所致，因为OH. 易与脱氧核酸及碱基反应并使其结构改变。,氧自由基的损伤作用,钙超载 (calcium overload)： 缺血组织恢复血流后，细胞内钙含量显著增高并导致细胞损伤的现象。静息状态下，细胞外Ca2+ 是细胞内Ca2+ 的104倍。细胞内Ca2+主要储存在线粒体和肌浆网
9、。,二、钙超载,细胞钙稳态的维持,Ryano 受体IP3 受体, Na+/Ca2+交换异常细胞内高Na+对Na+/Ca2+交换蛋白的直接激活细胞内高H+对Na+/Ca2+交换蛋白间接激活蛋白激酶C(PKC)活化对Na+/Ca2+交换蛋白的间接激活 生物膜损伤,缺血再灌注时钙超载的机制,1Ca2+,1Na+,1H+,Na+-H+ exchanger,1.Na+-Ca2+ 交换异常,Ca2+ overload, Na+/Ca2+交换异常细胞内高Na+对Na+/Ca2+交换蛋白的直接激活细胞内高H+对Na+/Ca2+交换蛋白间接激活蛋白激酶C(PKC)活化对Na+/Ca2+交换蛋白的间接激活缺血再灌
10、注时，内源性儿茶酚胺释放增加，通过1肾上腺素受体激活G蛋白磷脂酶C(PLC)介导的细胞信号转导通路。PLC 分解磷脂酰肌醇，生成IP3和DG，IP3促进钙释放，DG激活PKC促进NaH交换，进而增加NaCa2交换。,（一）缺血再灌注时钙超载的机制,(2)生物膜损伤细胞膜损伤，对Ca2+ 的通透性增加。肌浆网膜损伤，对Ca2+ 的回摄减少。线粒体膜受损，产能降低，细胞膜和肌浆网膜能量供应不足。,（一）缺血再灌注时钙超载的机制,线粒体功能障碍ATP生成再灌注后，细胞内钙增加，刺激线粒体钙泵摄钙，钙与线粒体内含磷酸根的化合物结合，形成沉淀，干扰线粒体的氧化磷酸化。 激活膜磷脂酶生物膜损害钙浓度升高可
11、激活多种磷脂酶，促进膜磷脂分解，造成生物膜的损伤。,（二）钙超载引起再灌注损伤的机制,引起心律失常由于NaCa2交换增加，形成一过性内向性离子流，在心肌动作电位后形成迟后除极。促进氧自由基生成通过增强钙依赖性蛋白激酶活性，加速黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶。 使肌原纤维挛缩，断裂，细胞破坏缺血再灌注后，细胞重新获得能量，在胞浆中高浓度钙的条件下，肌原纤维过度收缩。,（二）钙超载引起再灌注损伤的机制,结扎犬冠状动脉造成心肌局部缺血一段时间后，再开放结扎动脉恢复血流，部分缺血区并不能得到充分的血液灌流，这种现象被称为无复流现象（no-reflow phenomenon），见于心肌、脑、肾和骨骼肌等
12、，与缺血再灌注时中性粒细胞的激活及其致炎因子的释放造成微血管损伤有关。,三、白细胞的作用,缺血-再灌注后数分钟内，血管内皮细胞和白细胞表达大量黏附分子，如P-选择素表达增加，使白细胞沿内皮细胞表面缓慢滚动，形成不稳定黏附；再灌注4h后，整合素表达增加，白细胞和内皮细胞出现牢固黏附；同时，再灌注损伤时，内皮细胞和白细胞释放具有趋化作用的炎症介质，吸引大量白细胞穿过血管壁游走到细胞间隙，导致白细胞黏附聚集。,三、白细胞的作用,2）血管内皮细胞与噬中粒细胞介导的再灌注损伤（微血管损伤）：血液流变学改变、微血管口径改变、微血管通透性改变。大量致炎物质使细胞损伤。,三、白细胞的作用,一、心脏缺血再灌注损
13、伤的变化（一）心功能变化再灌注性心律失常 心肌舒缩功能降低 （二）心肌代谢变化 （三）心肌超微结构变化,第三节:IRI时机体的功能及代谢变化,IRI时心脏功能的变化,1. 缺血再灌注性心律失常心肌再灌注过程中出现的心律失常称为再灌注性心律失常，室性心律失常最为常见。动物试验中，再灌注性心律失常发生率可达5070。 再灌注性心律失常的发生与心肌缺血的时间长短有关。,2. 心肌舒缩功能降低心室舒张末期压力（VEDP）增大心室收缩峰压（VPSP）降低心室内压最大变化速度（dp/dt max）降低。,IRI时心脏功能的变化,（一）脑再灌注损伤时细胞代谢的变化：脑缺血后短时间内ATP、CP、葡萄糖、糖原
14、,乳酸，FFA兴奋性氨基酸： Glu、Asp 抑制性氨基酸 ：GABA、Gly （二）脑结构变化： 最明显的变化是脑水肿和脑细胞坏死，脑水肿的产生是膜脂质过氧化的结果。,二、脑IRI时的变化,一、减轻缺血性损伤，控制再灌注条件针对缺血原因，尽早恢复血流；采用低压、低流、低温、低PH、低钠、低钙的原则。二、改善缺血组织的代谢1. 补充糖酵解底物（磷酸己糖）； 2. 补充外源性ATP可使细胞膜蛋白磷酸化； 3. 针对线粒体损伤所致的氧化磷酸化受阻，应用氢醌、细胞色素C等进行治疗。,第四节:防治IRI的病理生理基础,三、清除自由基低分子清除剂：Vit E、Vit A； Vit C、GSH酶性清除剂：
15、CAT、GSH-px、SOD四、减轻钙超载五、各种预处理,第四节:防治IRI的病理生理基础,stable chemical,free radical,antioxidant,activation,oxidation(disease),stable chemicals,scavenging,Consequences of DNA damage,LONG-TERM CONSEQUENCES,Ageing,Cancer,other Disease,DNA REPAIR MECHANISMS,SHORT-TERM CONSEQUENCES,ABNORMAL GROWTH & METABOLISM,PH
16、YSIOLOGICAL DYSFUNCTION,CELL DEATH,Decreased cellular proliferation,Defective signalling pathways,Impaired protein/ gene expression,Genomic instability,DNA DAMAGE,自由基与放射损伤,高能射线的直接损伤作用高能射线的间接损伤作用放射损伤的继发效应,自由基与动脉粥样硬化,氧化修饰的低密度脂蛋白(oxidative LDL, oxLDL)和氧化应激对血管内皮细胞损伤造成大、中动脉内膜的慢性炎症性病变。oxLDL主要通过以下几条途径促进动脉粥
17、样硬化的发生发展吸引吞噬细胞向内膜中聚集引起内膜炎症刺激内皮表达粘附蛋白，分泌生长因子，促进炎细胞浸润和平滑肌细胞增生可抑制磷脂-胆固醇酰基转移酶，从而明显损伤胆 固醇的逆向转运,lipid hydroxides, hydroperoxides, aldehydes, epoxides, ketones, ceroid, isoprostanes,Necrotic core,Fibrous cap,Lipid peroxidation products in an atherosclerotic lesion are both enzymatically and non-enzymatical
18、ly produced.,Foam cell15-LOX ,缺血预处理,Ischemic Preconditioning, IPC,概念,多次的短暂缺血可以使心肌对随后发生持续性缺血的耐受性增强。,历史沿革,1986年 Murry 通过犬冠脉结扎，发现心肌IPC现象； 1990年Deutsch 首先发现人类重复血管球囊扩张可诱发心肌IPC； 1993年Yellow 首次采用人心肌标本直接证实这一现象存在。,Ischemic Preconditioning,The size of an infarct resulting from a 40-min occlusion of a branch o
19、f a dogs coronary artery could be greatly reduced if the heart were subjected to 4 brief periods of 5 min of ischemia and 5 min of reperfusion prior to sustained ischemia. The heart adapted itself within minutes to become resistant to ischemia-induced infarction.Murry CE et al. Preconditioning with
20、ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation 74:11241136, 1986.,Cardioprotections by PC,Limit infarct sizeMitigate myocardial stunningImprove Arrhythmias,Microcirculation Protections by PC,Blunt the impaired endothelial-dependent relaxation.Ameliorate capillary pluggin
21、g, leukocyte adhesion, and emigration.Reduce venous protein leakage effects of prolonged ischemia.,Acute preconditioning (classical preconditioning)within 2 hprotein synthesis-independentDelayed preconditioning (ischemic tolerance) 24 h - 72 h after the initial insult altered gene expressionsynthesi
22、s of proteins (antioxidant enzymes, NO synthase, etc.).,预处理的保护作用的特点,有记忆性 预处理后10分钟2小时内，再予缺血再灌注，心肌有记忆。呈双峰分布 初始阶段（典型缺血预处理）：数分钟3小时 延迟阶段(延迟预处理,第二保护窗)：数小时至数天或更长 非特异性 预处理方法各不相同,产生保护作用十分相似。 普遍性 生物界中存在的一种普遍规律，不同种属及器官都具有。,心肌IPC的临床证据,梗塞前48h心绞痛(Kloner) 改善心功能，降低死亡率 冠脉侧支循环血流增多 冠脉球囊成形术(PTCA)(Deutsch) 观察心绞痛程度、ST段偏移
23、、肺毛细血管楔压、心肌乳酸代谢产物等指标。 对心绞痛的适应性(Okazaki) 心绞痛病人二次连续负荷运动 观察两次发作时间，ST段压低幅度，局部心肌氧耗量，心脏大静脉Ado释放量。,IPC的可能机制,腺苷受体激活去甲肾上腺素 ATP敏感性K+通道 (KATP)蛋白激酶C （PKC） 内皮释放的介质 热休克蛋白,研究进展 缺血后处理,缺血后处理(ischemic postconditioning, I-postC)是缺血心脏有效的内源性保护现象，可以减轻缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)后心肌坏死与心肌功能障碍，减少恶性心律失常的发生。,I-postC的心脏保护机
24、制,内源性触发因子及其受体细胞内信号途径内源性心脏保护的细胞内效应器,内源性触发因子及其受体,触发因子包括腺苷、乙酰胆碱、阿片肽和氧自由基腺苷A1 和A3 受体乙酰胆碱M1受体阿片阿片受体缓激肽B2 受体、血管紧张素II过AT1 受体,细胞内信号途径,PI3K/Akt 途径 ：广泛存在于细胞中，活化的Akt 磷酸化下游底物发挥抗凋亡、促进细胞存活。MAPKs： I-postC激活ERK1/2 并限制心肌梗死范围；I-postC 通过抑制SAPK/p38 MAPK 减轻缺氧/ 复氧所致细胞凋亡PKC：PKC抑制剂chelerythrine消除在体兔心脏I-postC 限制心肌梗死范围的保护作用；
25、I-postC 对大鼠I/R 心肌的保护作用与诱导PKC 表达和转位有关。其它细胞内信号转导途径：PKG；PKA,内源性心脏保护的细胞内效应器,线粒体：开放mitoKATP 通道、抑制mPTP 开放，抑制氧自由基产生和钙超载而发挥心脏保护作用内质网(ER)：内质网应激（ERS)是加重I/R的重要因素，IPC抑制ERS 引起的蛋白合成和细胞凋亡，诱导ERS分子ORP150表达并保护神经元细胞。内源性保护蛋白：热休克蛋白、氧自由基清除酶、金属硫蛋白,举例,Laskey WK. 对17 位急性心肌梗死病人PTCA术中进行2 轮90 s 缺血和3-5 min 再灌注的I-postC，减轻了病人缺血所致ST 段抬高程度。 Circulation 2006; 113Staat P在一项多中心、随机对照临床试验中证实人类心脏存在I-postC 现象：所有病人于PTCA 再灌注后1 h 内进行4 轮1 min 的I-postC，肌酸激酶(creatine kinase,CK)漏出减少，并增加了微血管的开放程度。 Circulation 2005，112Ma XJ,等也证实I-postC 可显著降低急性心肌梗死患者CK、CK-MB 的漏出和脂质过氧化损伤，并明显改善冠状动脉血流和内皮依赖性血管舒张功能。Scand CardiovascJ 2006; 40,
