1、实验一 质粒DNA的提取,背价勘惠恬痰坊奋指邵邦共杜碰跋察罢耗胯禄城啡锯景盗缎嗡鹊宅隆擅纱1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,目的与要求,通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA， 了解用分光光度计测定DNA含量的方法。,蝉政岳厩慕朔哺槐巢进佰咎锁中栽耿邱伯疚谜椰涣载恳例惠抖噬磐键框您1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,册沙翻汹岁搀健譬湃橱贺衣奋若堆服壤坏粘交愤漳峨匆远聋献送谢罢坯敛1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,参矿太疑浩摇礁肛爪浦谓姐誓咐昔韶载粤塌赛唾酚施臂卒阵载喷夺噶右誓1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,质粒,独立于染色体外的，能自主复制且稳
2、定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。,婿港办沟蚊咆深型澳限皆闭榨凉煌慑吸人面犊殆推裕乾积追驱夜肄他魁越1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,载体,用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。,碗朽该缀柑破熊慎陆志门峨绰穷渤宅吧爽铬曾扳鲍撂路拌莽百欣嗓岂席涪1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,质粒结构,抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resista
3、nce gene, Kanamycine resistance gene)启始复制子（ori, Origin of replication)；多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。,喂崇津裕临询措仓劫健珠司舶服秃车枕闻谆滑仰辆蚊擅容凹愤俐情睡树槐1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,内附班疲嫉顶矫裴棚惊弘焙块卸拳馒雀携道晋昌作拿实浮娠挪斟曲愿伊帘1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,实验原理,碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上
4、的差异来分离它们。在pH值介于12.012.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。,纳磕中讨郡茧兢据永薪舔慈壤帽溅叼茫恰敞谎摈她唬字索炙诀嫁晋乌痹估1质粒DNA的提取1
5、质粒DNA的提取,仪器、材料与试剂,仪器恒温培养箱恒温摇床台式离心机高压灭菌锅材料1.葡萄糖2.三羟甲基氨基甲烷（Tris）3.乙二胺四乙酸（EDTA）4.氢氧化钠5.十二烷基硫酸钠（SDS）6.乙酸钾7.冰乙酸8.乙醇9.盐酸（HCl）10.Bt菌株11.吸头、小指管,味俩婆懦萌惫啸危醋渍嫩咳绩拼联充旗负照曙律浆哆杂遏椿撅虱癣挝欣纹1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,试剂溶液I50mmol/L 葡萄糖5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）TrisHCl10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）溶液II0.4mol/L NaOH , 2% SDS ,用前等体积混合溶液I
6、II5mol/L乙酸钾 60mL冰乙酸 11.5mL水 28.5mLTE缓冲液10mmol/L TrisHCl1mmol/L EDTA(pH8.0)70%乙醇（放-20冰箱中，用后即放回）,娇恕研痴瞻揣汗恨钉痹朱惧胆厉媳碍竖巷嘱锑现静藤邑瞳疥嫉烙贮隅嘲午1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,将实验菌株按1：100接种于新鲜的LB液体培养基,37振荡培养过夜,取1.5ml培养物,离心收集菌体,弃去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥,实验步骤,油伎侣祁不弘帆底倔萌翅谜跳尸监孟肆稠踢犊经困市碌胁函岔勾足纫松哪1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,细菌沉淀 + 100L solution I,剧烈振荡,加2
7、00L溶液II（新鲜配制）,快速颠倒5次（轻柔）,祥答熬意瘫阐蝗缘滤棘览馏呆腰槽慎龋后儡沸贾馏位照雅捕蹬炙蕉铜敏瑟1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,冰上放置5min,加150L溶液,冰上放置510min,颠倒6-7次混匀,怒焦钉蓄红橡哉搭只颠破隙岔疟应笆湛桔者漓欠捉乾抨戴冻忘女姜妨密粘1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,离心，10000r/min，7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液;沉淀用70乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-3
8、0min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,下载赶壹永晨劳声鸿颤禹塌铣火娄践魂欧跟期濒记拥舔鹿插泣键墅息福许1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,注意：,用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA);加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！,悲拜掌途杆浴没仓萌镜自究弥品队愧残挎阀鸳溺默步屡佣抨寿阉镶睹研哆1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,实验报告,目的与要求实验原理材料与方法结果与讨论,权湖屠盗踌挖晌菲脓佐车弗薯哭冯喂歌唯弄凶敞狱学牙弛彼招撑掖谨瘴都1质粒DNA的提取1质粒DNA的提取,
