1、1实验一 质粒 DNA 提取纯化、DNA 电泳检测一、实验目的1掌握质粒 DNA 的制备的原理和方法2了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1质粒 DNA 的制备方法质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链 DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于 1200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的 DNA。质粒 DNA 的制备包括 3 个步骤：培养细菌，使质粒 DNA 大量扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒 DNA。主要方法包括：碱裂解法：0.2mo
2、lNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸 40 秒；SDS 裂解法：10%SDS，一般用于质粒大量提取。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒 DNA。2碱裂解法质粒 DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端 pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒 DNA 变性，去除变性条件又可以使 DNA 复性。碱裂解法根 据 共 价 闭 合 环 状 质 粒 DNA 和 线 性 染 色 体 DNA 在 拓 扑 学 上 的 差 异 来 分 离 质 粒DNA。 SDS 是一种阴离子表面活性剂，
3、它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒 DNA 及细菌基因组 DNA 从细胞中同时释放出来。细 菌 环 状 基 因 组 DNA 在 操 作 过 程 中 会 断 裂 成 线 状 DNA 分 子 ， 在 pH 值 介 于12.0 12.5 这 个 狭 窄 的 范 围 内 ， 线 性 的 DNA 双 螺 旋 结 构 解 开 而 被 变 性 ， 尽 管 在 这 样 的 条 件 下 ，共 价 闭 环 质 粒 DNA 的 氢 键 会 被 断 裂 ， 但 两 条 互 补 链 彼 此 相 互 盘 绕 结 合 在 一 起 。 当 加 入pH4.8 乙 酸
4、钾 缓 冲 液 时 ， pH 恢 复 至 中 性 ， 因 为 共 价 闭 合 环 状 的 质 粒 DNA 的 两 条 互 补 链 仍 保 持 在 一 起 ， 因此 复 性 迅 速 而 准 确 ， 而 线 性 的 染 色 体 DNA 的 两 条 互 补 链 彼 此 已 完 全 分 开 ， 复 性 就 不 会 那 么 迅 速而 准 确 ， 它 们 相 互 缠 绕 形 成 不 溶 性 网 状 结 构 ， 而 复 性 的 质 粒 DNA 恢 复 原 来 构 型 ， 保 持 可 溶 性 状态 。 通 过 离 心 ， 就 可 去 除 染 色 体 DNA 和 蛋 白 质 -SDS 复 合 物 等 物 质 ，
5、 最 后 用 酚 氯 仿 抽 提 纯 化 上清 液 中 的 质 粒 DNA， 乙 醇 或 异 丙 醇 沉 淀 就 可 得 到 纯 的 质 粒 DNA，之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。3质粒琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳技术（agarose gel electrophoresis）是分离、鉴定和提纯 DNA 片断的有效方法。琼脂糖凝胶可分辩 0.16.0kb 的双链 DNA 片段。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA 分子的高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA
6、几乎具有等量的静电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子，如 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒2DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)；开环质粒 DNA，即共价闭合环状质粒 DNA 1 条链断裂(open c
7、ircular DNA , OCDNA)和线状质粒 DNA，即共价闭合环状质粒 DNA2 条链发生断裂(linear DNA, LDNA)。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。三、仪器及试剂1仪器及耗材：冷冻离心机、微量移液器、1.5ml EP 管、枪头、凝胶槽、电泳仪等。2试剂及配制：溶液（GET 缓冲液）：25 mmol/LTris-HCl （pH8.0 ），10 mmol/L EDTA，50 mmol/L 葡萄糖，pH8.0溶液 II（变性液）：200 mmol/
8、L NaOH，1% SDS配制：1 ml10% SDS 50 l1N NaOH 200 l取以上溶液，用灭菌去离子水定容至 1ml，充分混匀，现用现配。溶液 III (醋酸钾液)：3 mol/L 醋酸钾（KAc ）缓冲液，pH 5.6。 5 mol/L 冰醋酸配制：100 ml醋酸钾 29.4g冰醋酸 11.5 ml加入 60 ml 去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至 100 ml。高温高压灭菌后，4保存。其它试剂：TE（pH8.0）、饱和酚、酚 /氯仿（25：24）、无水乙醇、70乙醇、电泳缓冲液、6上样缓冲液四、实验步骤1接种细菌于 LB 液体培养基中， 37培养
9、过夜（E coli. Top10, pUC19 质粒） ；2取细菌悬液 1mL 于 1.5mLEP 管中，4000 rpm/min，离心 2min；3弃上清，加入 100l 溶液；4加入 200l 溶液 II ，颠倒混匀，静置 2min；5加入 150l 溶液 III，颠倒混匀，静置 5min；64 ， 12000 rpm/min，离心 10min；7取 400l 上清移入另一 EP 管，加等体积饱和酚，振荡混匀，12000 rpm/min，离心10min；8取约 300l 上层水相移入另一 EP 管，加等体积酚/ 氯仿，振荡混匀， 12000 rpm/min，离心 10min；9取 200l
10、 上层水相移入另一 EP 管，加 2 倍体积无水乙醇，混匀置-201.5 小时，沉淀 DNA；1012000 rpm/min，离心 10min，弃上清，加入 1mL70%乙醇洗涤 DNA 沉淀，小心吸弃乙醇；11开盖放置 5 min 干燥 DNA，加入 15l TE 溶解 DNA；12加入 3l 6上样缓冲液，混匀，18l 分两次上样于 1%琼脂糖凝胶电泳；313上样 9l DNA marker。14150V, 60min，紫外灯下观察结果。五、结果与讨论1质粒电泳结果质粒 DNA 在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中，被染成橘黄色。如下图所示，质粒DNA 可以观察到 3 条带，电泳速度最慢的条带
11、显色最浅。 质粒 DNA 有 3 种构型，即共价闭合环状质粒(cccDNA)、开环质粒 (OCDNA)和线状质粒 DNA (LDNA)。在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。本次实验的结果中的三条带，也可推测为：超螺旋质粒 DNA、线状 DNA 和开环质粒 DNA。2细菌基 因 组 DNA 与质粒 DNA 分离注意事项在加入细菌裂解液后， 需要颠倒混匀，细 菌 环 状 基 因 组 DNA 在 操 作 过 程 中 会 断 裂 成 线 状DNA 分 子 。这时应当上下颠倒轻轻混匀，以避免产生小分子量的基 因 组 DNA 片断，最后污染提取的质粒 DNA。3溴酚蓝指示剂上样缓冲液中含有溴酚蓝（Bromophenol blue，别名四溴苯酚磺酞，最大吸收波长 422nm） ，以 0.25%溴酚蓝作为电泳指示剂。溴酚蓝结构式如右图，分子式 C19H10Br4O5S，分子量 669.96，氨基酸的平均分子量 110 Da，每对核苷酸的平均分子量是 659Da，电泳时溴酚蓝会跑在前面，在到达凝胶底部 3/4 位置时，即可停止 电泳，进行结果观察。
