1、论文开题报告：基于 TRAP 标记的半夏遗传多样性研究论文开题报告：基于 TRAP 标记的半夏遗传多样性研究发表时间:2013-9-12 10:25:58大学本科毕业论文(设计)开题报告学院： 化工学院 专业班级： 08 园艺 课题名称基于 TRAP 标记的半夏遗传多样性研究1、本课题的的研究目的和意义：遗传多样性是物种和生态多样性的基础，一般指种内不同群体和个体遗传多态性程度即种内基因变化。 种内遗传多样性丰富，物种对环境的变化适应能力强，进化潜力大。 由于现在半夏盲目引种，栽培不规范及栽培环境不合格导致半夏种内基因变异及品种退化，药材产量下降，影响经济效益，开展遗传多样性研究对半夏分类，品
2、种鉴定，引种和培育新品种具有巨大意义。2、文献综述（国内外研究情况及其发展）：靶位区域扩增多态性(Target Region Amplified Polymorphism,TRAP) 是一种新型的基于 PCR 的分子标记 ，由美国农业部北方作物科学实验室 Hu 与 Vick 于 2003 年提出46 。TRAP 标记与 SRAP、RAPD 和 A和溴酚蓝混合均匀，电泳条带清晰。5、研究思路、方法和步骤：步骤：（1）依次用 H2O、ddH2O 充分洗涤玻璃板和间隔片，再用无水乙醇擦拭玻璃板，晾干。直接用无水乙醇清洗样品梳。（2）凝胶膜板的装配：将较大的（不带凹口）玻璃板平放在实验台上。用少量凡士
3、林轻涂间隔片，防止其滑动。将内板（带凹口的玻璃板）放在（不带凹口）玻璃板上，放妥。用夹子将两玻板夹紧，为防止漏胶，底边用防水胶带密封。将两玻板夹在制胶板上，并放入琼脂糖密封槽中。注意：玻板要放在密封槽的中间，使玻板的四周都留有空间，以便琼脂糖能够流到玻板的前后左右。制备一定量（每块胶约需 30ml）的 1%的琼脂糖溶液，加热使之透明澄清。趁热倒入琼脂糖密封槽中，胶凝固后可以密封玻板底部的侧面和底面。（3）聚丙烯酰胺凝胶的制备根据玻璃板大小及间隔片厚度计算所需凝胶体积，并配胶、灌胶。 （注意：操作时要戴手套！并且在托盘上进行，以免溶液溅出！操作动作要迅速！）吸取 9.95ml 30%丙烯酰胺、2
4、9.7ml dH2O、10ml 5TBE 放入小烧杯中，混匀。 （6.0%的聚丙烯酰胺凝胶）再加入 0.35ml 10%过硫酸胺、0.0175ml TEMED，轻轻旋转混匀。将垂直胶板略倾斜，小心将凝胶倒入两块玻璃板之间，待凝胶离板顶约 3mm 处停止。胶板垂直放好，插入合适的样品梳，勿使梳齿下形成气泡，若有气泡，用 1mL 注射器吸出。室温中聚合 12h，若凝胶回缩明显，应补加。梳齿下出现折光带时，表明聚合反应已经完成。（4）电泳聚合完成后，在梳子周围及其顶部喷些 1TBE，小心取出梳子。用 1mL 注射器吸取 1TBE 冲洗加样孔，小心移去琼脂糖密封槽，用解剖刀小心除去凝胶底部的胶带，回收
5、琼脂糖。将凝胶直立放入电泳槽，注意有凹口的玻璃板朝里，面向缓冲液槽放置，用夹板固定好。在电泳槽的上下槽中灌满 1TBE 溶液，驱尽凝胶底部附着的气泡。用 1TBE 溶液冲洗加样孔。微量移液器在点样板上：5l DNA +1l 6Loading Buffer，充分吹吸混匀。上样时，切勿让样品溢出槽外。接通电源，正极与下槽相连。120V 电压下电泳 2.5h。电泳毕，从电泳槽中取出玻璃板，放在工作台上，用解剖刀从夹层一角轻撬，移去上面的玻板。用注射器针头使附着在间隔片内侧的凝胶脱离，再用 ddH2O 小心冲洗下凝胶，置染色液中染色并进行结果观察。 （5）染色电泳后采用银染的方法，银染主要步骤：(1)
6、去离子水洗脱 3min；(2)浸泡于 0.1%AgNO3 染色溶液中，在脱色摇床上染 810min(0.1%AgNO3)； (3)显影液脱色 34min 至条带显色清晰，本底适宜（该步骤所用时间并不十分严格，可观察其显色情况，达到试验要求即可，时间过长则背景过深，时间太短则显色不完全。因其移出显影液后颜色还会加深一些，因此可略微提早结束显影） ；(4) 0.75% 碳酸钠终止反应；(5)去离子水洗脱，最后用相机或是在凝胶成像系统中拍照。6、本课题的进度安排：2012.02 阅读相关文献，提取半夏基因组 DNA。 2012.03-05 对全国各地半夏种植资源进行遗传多样性检测。 7、参考文献：1 Yang M, Chen K. Analysis of genetic diversity of gem.
