1、 荆芥挥发油对 LPS 所致大鼠急性肺损伤模型肺组织中 NF-B， IB，TNF- 和 IL1- 含量的影响作者：解宇环 沈映君 金沈锐 徐世军【摘要】 目的观察荆芥挥发油（ VOHS）对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠模型肺组织中核因子-B(NF-B)，IB-，IL1- 和 TNF- 含量的影响，探讨荆芥挥发油抗炎作用的细胞信号调控转导机制。方法雄性 SD 大鼠 60 只随机分为 6 组，分别为空白对照组，模型对照组，阳性对照组（地塞米松），荆芥挥发油高、中、低剂量组。尾静脉注射 LPS(1.0 mg/kg 体重)或生理盐水，6h 后处死动物，酶联免疫吸附法（ELISA）测定肺
2、组织 NF-B p65、磷酸化 IB-、IL1- 和 TNF- 含量。结果与模型对照组比较，VOHS 高、中、低剂量组均可显著降低大鼠肺组织中的 NF-B p65和磷酸化 IB- 含量，差异有统计学意义（P0.05， P0.01, P0.001），同时 VOHS 各剂量组也可显著降低大鼠肺组织中IL1- 和 TNF- 含量，差异有统计学意义（P0.01，P0.001）。结论荆芥挥发油抗炎作用机制之一可能是抑制 IB- 磷酸化降解和NF-B 活性，进而减少炎症相关细胞因子 IL1-，TNF- 的合成和释放。 【关键词】 急性肺损伤 脂多糖 荆芥挥发油 抗炎机制Abstract:Objective
3、To investigate the effects of the volatile oil of Herba Schizonepetae on level of NF-B , IB， IL1- and TNF- in lung tissue of ALI rats induced by LPS ,so to explore the modulator mechanisms of the volatile oil of Herba Schizonepetae in signal transduction of inflammation. MethodsSixty male rats were
4、randomly divided into six groups: normal control group, model group, LPS+Dex group and three volatile oil of Herba Schizonepetae groups. LPS was injected intravenously to prepare ALI model. The level of NF-B ,IB , IL1- and TNF- in lung homogenates were measured by ELISA. ResultsThe level of NF-B in
5、rat lungs significantly increased after LPS stimulation than that of the normal group (P0.05， P0.01, P0.001); the Volatile oil of Herba Schizonepetae groups could decrease the level of NF-B ,IB , IL1- and TNF- in rat lungs of the model groups（P0.01，P0.001）.ConclusionThe volatile oil of Herba Schizon
6、epetae can inhibit the IB- phosphorylation and NF-B activivty, then reduce the synthetise and release of cytokines(IL1-,TNF-). This may be one of the mechanism that VOHS has the effect of anti-inflammation .Key words:Acute lung injury; Lipopolysaccharide; The volatile oil of Herba Schizonepetae; Mec
7、hanism of anti-inflammation荆芥为常用解表药，前期的实验已经证实其挥发油对多种炎症动物模型均具有良好的抗炎作用1,2。核因子-B 对前炎症因子 IL1 和 TNF 的基因表达调节起重要作用,而 NF-B 的活化受 NF-B 抑制蛋白 IB 的调控3，荆芥挥发油能否通过干预 NF-B 信号转导途径达到抗炎作用，目前尚无研究报道。本研究应用脂多糖（LPS）复制大鼠急性肺损伤（ALI) 模型，通过观察荆芥挥发油 (VOHS) 对大鼠肺组织中核因子 B p65， IB-，IL1- 和 TNF- 含量的影响进一步探讨荆芥挥发油抗炎作用机制。1 材料1.1 荆芥挥发油荆芥(Her
8、ba Schizonepetae)购自成都市中药材公司，由我校中药鉴定教研室王光志博士鉴定符合现行中国药典药用标准，按中国药典2005 版部附录D 挥发油测定法中甲法提取，得淡黄色澄明油状液体，气味芳香，挥发油含量为 1.2%，无水硫酸钠充分脱水后，密闭贮存于棕色瓶中,4冰箱保存备用，实验时用 0.5%吐温-80 溶液配制使用。前期实验测得 VOHS 小鼠灌胃给药 LD50 为 1.10 ml/kg，实验中所用 VOHS 剂量约为 LD50 的1/10,1/20,1/40。1.2 动物健康 SD 雄性大鼠（SPF 级），体重 180220 g，由成都中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号为
9、SCXK（川）2004-12。1.3 试剂 LPS（E. Coli 0111：B4）Sigma 公司产品；地塞米松磷酸钠注射液，西南药业股份有限公司，批号 66040099；Rat NF-B p65 ELISA Kit， Rat IB- ELISA Kit，批号 0504； Rat IL1-ELISA Kit，批号 0509；Rat TNF- ELISA Kit，批号 0509，以上均由上海康成生物有限公司提供。 1.4 仪器 Multiskan MK3酶标仪, Thermo 公司； JY96-超声波细胞粉碎机，宁波新芝科器研究所。2 方法与结果2.1 LPS 致大鼠 ALI 模型的制备取 S
10、D 雄性大鼠（SPF 级）60只，按体重分层，随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组（地塞米松），VOHS 高、中、低剂量组，每组 10 只。除阳性对照组第 5 天予地塞米松腹腔注射 1 次给药外，其他组均连续灌胃给药5 d，1 次/d，空白对照组和模型对照组灌相同体积的生理盐水。末次给药后 1 h，每鼠尾静脉注射 LPS 1.0 mg/kg 体重，6 h 后处死动物，在无菌条件下取出肺脏，用无菌滤纸吸干肺脏表面的血液后锡箔纸包裹，-70 保存。2.2 肺组织总蛋白的抽提及指标的检测称取肺组织 250 mg,并加入预冷的蛋白质抽提试剂，以超声波细胞粉碎机低速粉碎细胞，低温冷冻离心 14 0
11、00 r/min,15 min 后，取上清液，按 BCA 法测定蛋白浓度。用 ELISA Kit，参照试剂盒说明测定活化的 NF-B p65 和磷酸化的 IB- 以及 IL1-,TNF- 含量：采用双抗体夹心法。酶标板上已包被捕获抗体。待测样品加入微孔孵育后加检测抗体孵育，随后加 HRP 偶联的抗小鼠二抗，最后加 TMB 显色。酶标仪 450 nm 处读OD 值，OD 值大小与蛋白的量成正比。2.3 统计方法实验数据均以s 表示,统计采用单因素方差分析（ANOVA）。2.4 结果2.4.1 VOHS 对 LPS 诱导的大鼠 ALI 模型肺组织中 NF-B p65，IB- 含量的影响结果见表 1
12、。结果表明，造模各组与空白对照组相比，NF-B p65 含量升高，且差异有统计学意义（P0.05， P0.01, P0.001）。与模型对照组比较， VOHS高、中、低剂量组均可显著降低大鼠肺组织中的 NF-B p65 含量，差异有统计学意义（P0.05， P0.001）；VOHS 高、中、低剂量组均可降低大鼠肺组织中的磷酸化 IB- 含量，差异有统计学意义（P0.05， P0.01, P0.001）。表 1 VOHS 对 ALI 大鼠肺组织 NF-B p65 及 IB- 含量的影响（略）2.4.2 VOHS 对 LPS 诱导的大鼠 ALI 模型肺组织中 TNF-，IL1-含量的影响结果表明，
13、造模各组与空白对照组比较，TNF-，IL1-含量明显升高，且差异有统计学意义（P0.001）。与模型对照组相比，VOHS 各剂量组均可降低大鼠肺组织中 IL1- 和 TNF- 含量，差异有统计学意义（P0.01，P0.001）。结果见表 2。表 2 VOHS 对 ALI 大鼠肺组织 IL1- 及 TNF- 含量的影响（略）3 讨论急性肺损伤(ALI)是临床常见的危重病症, 其病理基础是由多种炎症细胞(巨噬细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞等) 介导的肺脏局部炎症反应和炎症反应失控所致的肺毛细血管膜损伤，是多器官功能障碍综合征(MODS) 或全身炎症反应综合征(SIRS)中最常出现的一种器官组织损伤4
14、。革兰氏阴性细菌内毒素的主要成分脂多糖(LPS)具有明显的致 ALI 作用5。LPS 可引起中性白细胞(PMN)在肺内聚集、激活,黏附于内皮细胞,释放氧自由基、蛋白水解酶等而参与 ALI 的发生 6。研究表明，LPS 的这些作用是通过一系列细胞信号转导途径实现的7，其中 NF-B 信号通路是与机体免疫及炎症反应最为密切的相关的信号通路。NF-B 是一种几乎存在于所有真核细胞中的核因子,对细胞的生长、分化、黏附、凋亡及炎症反应等具有十分重要的调节作用。典型的 NF-B 复合体由两个亚单位 P50、P65/c-Rel 组成，并主要通过与其抑制蛋白 IB 紧密结合以无活性的形式存在于细胞浆中。外源性
15、损伤或毒性物质(如细菌毒素) 都可诱导 NF-B 的活化，进而调控免疫炎性基因的转录8。细菌LPS 通过与血浆中急性期蛋白的脂多糖结合蛋白(LBP)形成 LPS-LBP复合物,后者能与单核-巨噬细胞膜上的 CD14 受体紧密结合。但是,CD14 为糖基化磷脂酰肌醇膜蛋白,锚定在细胞膜上,无胞内区不能独立进行信号转导9。近年研究已经证实,TOLL 样受体(toll-likereceptor,TLR)4 在 CD14 和 LBP 存在时可作为 LPS 的信号转导受体,使 TLR4 聚合而活化 ,通过其胞质结构域募集细胞内髓样分化蛋白88(MyD88)和 IL1 受体相关激酶发生自身磷酸化,引发酶系
16、级联反应,使 IB 磷酸化与 NF-B 解离。正常时，NF-B 的 P50、P65 亚基与抑制性亚基 IB 形成三聚体存在于胞浆中。IB 磷酸化后被非特异性蛋白酶水解，从而使 RelA 蛋白的核定位信号暴露，导致 NF-B被激活后转位入核,活化后其亚基 p50、p65 由细胞质进入细胞核内,与其目的靶基因的启动子或增强子上特定的 B 系列特异结合，启动和调控一系列参与炎症反应的炎症因子基因表达（如促炎细胞因子、黏附分子、环氧化酶等）从而介导多种炎症性疾病的产生8 。 在机体对组织损伤和感染的炎症反应中，炎性细胞因子(IL1-、 TNF- 等）介导的反应是创伤、感染反应的基本部分，但在炎症免疫反
17、应过程，机体在重度感染时，在内毒素刺激下过量释放 IL1-、 TNF-，进一步激活多形核白细胞和内皮细胞等效应细胞，释放炎性介质，形成瀑布效应10，从而导致多脏器功能障碍及衰竭11,12，如能阻断炎性细胞因子的过量产生，则能阻止损害性炎症反应的发生和发展。本研究证实， LPS 刺激后，大鼠肺组织中 NF-BP65、磷酸化 IB-、IL1- 和 TNF- 含量显著升高，这说明 LPS 可能通过 NF-B 信号转导途径的过度激活而诱导肺损伤。而 VOHS 给药各组大鼠肺组织中 NF-B 和磷酸化 IB- 含量显著减少，同时 IL1- 和 TNF- 水平显著降低。可见 VOHS 可通过抑制 IB 的磷酸化，保护 IB免于降解，而影响 IB- 与 NF-B 的解离，减少 NF-B 转位、入核，并启动炎症因子相关基因，从而减少炎症因子 IL1-、TNF- 表达，减轻肺组织损害。因此我们推测，VOHS 抑制 NF-B 信号转导途径的过度激活，进而减少炎症介质的合成和释放，是其抗炎的作用机制之一。关于 VOHS 对 NF-B 信号通路具体的作用机制还有待进一步研究。【
