1、 荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒的作用作者：蒋蔚峰，陈建宗，张娟，张金平，贾新 【摘要】 目的： 观察荔枝核总皂苷体外抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用. 方法： 以 HepG2.2.15 细胞为靶细胞，分别用不同浓度的荔枝核总皂苷和拉米夫定培养液培养，采用 ELISA 法及荧光定量 PCR法测定细胞培养上清 HBsAg, HBeAg 及细胞外 HBV DNA 含量，评价荔枝核总皂苷对体外 HBV 的抑制作用. 结果： 荔枝核总皂苷对体外培养 HepG2.2.15 细胞分泌的 HBsAg, HBeAg 及细胞外 HBV DNA 的 50抑制浓度(IC50)分别为 0.096，0.085 和 0.
2、128 g/L，治疗指数(TI) 分别为 6.98，7.88 和 5.23. 0.25 g/L 拉米夫定组和 0.4 g/L 荔枝核总皂苷组在 d 3，d 6 对体外培养 HepG2.2.15 细胞分泌的HBsAg，HBeAg 及细胞外 HBV DNA 的抑制作用差异无统计学意义（P0.05） . 结论： 荔枝核总皂苷具有一定的体外抗 HBV 作用. 【关键词】 荔枝核；皂苷类；HepG2.2.15 细胞；肝炎病毒，乙型0 引言我国属乙型病毒性肝炎高流行区，2004 年中国疾病预防控制中心调查显示我国 HBsAg 感染率高达 9.091. 目前，尚没有理想的治疗慢性乙型肝炎的药物. 我国有数千
3、年应用中草药治疗疾病的传统和经验，从中已发现了不少抗乙型肝炎病毒(HBV)的药物. 荔枝核是无患子科植物荔枝（Litchi chinensis Sonn）的成熟种子，又名荔仁或荔核，味甘、微苦，归肝、肾经，具有行气散结、祛寒止痛的功效. 其化学成分包括皂苷、蒜质和脂肪酸等多种物质. 研究发现，荔枝核黄酮类提取物对乙肝病毒 HBsAg，HBeAg 以及 HBV DNA 有明显的抑制作用2-3. 但荔枝核皂苷是否具有抑制 HBV的作用，目前尚未见文献报道. 我们采用 HepG2.2.15 细胞为靶细胞，观察不同浓度荔枝核总皂苷体外对 HBV 的抑制作用 .1 材料和方法1.1 材料 HepG2.2
4、.15 细胞由第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心王平忠博士惠赠；噻唑蓝(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)和G418(Sigma 公司) ；HBsAg 和 HBeAg 的 ELESA 检测试剂盒(华美生物公司)；Model 1680 酶联免疫检测仪(德国 BioRad 公司)；HBV DNA 提取及扩增荧光检测试剂盒(广州中山大学达安基因股份有限公司)； DMEM 高糖培养液、胰蛋白酶、EDTA 、L谷氨酰胺、胎牛血清(Gibco 公司)； PE7700 型自动荧光 PCR 检测仪(美国 Perkin Elmer 公司). 荔枝核总皂苷由第四军医大学药剂科提取，实验时用 DMSO 溶解后再以
5、含 100 mL/L 胎牛血清的 DMEM 培养液稀释，分别配制成 0.4，0.2，0.1，0.05，0.025 g/L 共 5 个浓度梯度，含药培养液中 DMSO 浓度不超过 10 g/L. 拉米夫定由葛兰素史克制药有限公司提供，实验时用培养液稀释成 0.25 g/L.1.2 方法 HepG2.2.15 细胞培养于 DMEM 高糖培养液( 含 100 mL/L 胎牛血清，400 mg/L G418 及 0.3 g/L 谷氨酰胺，56 g/L 碳酸氢钠调pH 值至 7.2)中，培养于 37，饱和湿度，50 mL/L CO2，每 72 h 更换培养液 1 次. 细胞长满瓶底约 80%，用 2.5
6、 g/L 胰蛋白酶和 0.2 g/L EDTA 11 混合消化 35 min，13 分瓶传代. 取对数生长期状态良好的细胞，调整细胞浓度为 1107 个/L ，接种于 96 孔板，每孔0.2 mL，培养箱培养 24 h，待细胞贴壁后进行实验 . 荔枝核总皂苷按配制不同浓度分组，同时设仅加细胞培养液的阴性对照组和含 0.25 g/L 拉米夫定的阳性对照组，每组设 3 个复孔 . d 3 更换同样浓度含药培养液及对照培养液 1 次. 各孔用药 d 3，d 6 将吸取的上清液置于-20 冰箱保存待检. 另分别收集贴壁后 16 d 的细胞培养上清，-20保存，统一检测. 使用 ELISA 法检测培养上
7、清的 HBsAg 和HBeAg，显色反应后，酶标仪读取 A450 nm 值，绘制分泌曲线.1.2.1 药物对细胞毒性试验荔枝核总皂苷配制成0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625 g/L 共 8 个浓度梯度，HepG 2.2.15 细胞以 1107 个/L 接种于 96 孔培养板，细胞贴壁后各药物组换入相应含药培养液，阴性对照组换入正常培养液. 于加药 d 6 吸去上清液，每孔加 5 g/L MTT 20 L，37孵育 4 h，弃上清液后每孔加入 DMSO 150 L，震荡 10 min，测 A490 nm 值. 计算细胞存活率() =(实验组 A49
8、0 nm 值/ 阴性对照孔 A490 nm 值)100；半数中毒浓度(TC50)= Anti loglogB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率 C，(A抑制 50药物浓度，B抑制 50药物浓度，C=log 稀释倍数).1.2.2 上清液 HBsAg 和 HBeAg 测定根据双抗体夹心 ELESA 试剂盒说明测定培养上清液 HBsAg 和 HBeAg. 计算抗原抑制率()=(阴性对照孔 A 值-实验孔 A 值)/阴性对照孔 A 值100；50药物抑制浓度(IC50) Anti loglogB+(50-B) 的抑制百分率/(A-B) 的抑制百分率C，(A抑制 50药物浓度，B 抑制
9、 50药物浓度，C=log稀释倍数).1.2.3 细胞培养上清 HBV DNA 检测按照 Taqman HBV 核酸扩增荧光检测试剂盒说明操作. 引物序列为 P1：5ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3； P2：5ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA3 ；荧光探针序列为：5GGCTAGTTTACTAGTGCCATTTG3. 各反应管放入 PCR 仪，按下列条件扩增：93 2 min 预变性，然后 93 45 s 到 55 1 min 循环扩增 10 个循环，再按 93 30 s 到 55 45 s 循环扩增，共 30个循环. 反应结束后由计算机自动分析出 HBV DNA
10、定量结果，计算 HBV DNA 抑制率. HBV DNA 抑制率( )=(阴性对照孔 HBV DNA拷贝数实验孔 HBV DNA 拷贝数)阴性对照孔 HBV DNA 拷贝数100.1.2.4 治疗指数的计算 HBsAg，HBeAg 和 HBV DNA 的治疗指数(TI)半数毒性浓度(TC50)/半数有效浓度(IC50). 其中 TI2 为有效低毒；1TI2 为低效有毒； TI1 为毒性作用. TI 越大，则表明该药对 HBsAg，HBeAg 和 HBV DNA 抑制作用越强或细胞毒性越小.统计学处理： 数据以 xs 表示，应用 SPSS 11.5 统计软件进行分析，组间均数比较采用方差分析及
11、LSDt 检验，P0.05 为有统计学意义.2 结果HepG 2.2.15 细胞经传代培养，在贴壁后 16 d，其培养上清中的HBsAg 和 HBeAg 分泌量随着细胞培养时间的延长而逐渐增加（图1）.图 1HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 的时间曲线 (n=3, xs)2.1 药物对 HepG2.2.15 细胞的毒性荔枝核总皂苷对细胞的毒性作用较小，0.8，0.4 g/L 组对细胞的抑制率分别为 53.7和39.3，TC50 为 0.67 g/L. 而 0.25 g/L 拉米夫定组对细胞的抑制率为43.4.2.2 药物对 HepG2.2.15 细胞培养上清 HBsA
12、g 和 HBeAg 的抑制作用荔枝核总皂苷的不同浓度对 HBsAg 和 HBeAg 分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长，抑制也随之增强. d 6 HBsAg 的 IC50 为 0.096 g/L，HBeAg 的 IC50 为 0.085 g/L（表 1）.2.3 药物对 HepG2.2.15 细胞培养上清 HBV DNA 的抑制作用荔枝核总皂苷的不同浓度对 HBV DNA 的分泌均有一定的抑制作用，且随剂量的增加、治疗时间的延长对 HBV 的抑制也随之增强 . d 6 HBV DNA 的 IC50 为 0.128 g/L（表 2）.2.4 治疗指数荔枝核总皂苷对 HepG2
13、.2.15 细胞分泌的HBsAg，HBeAg 及 HBV DNA 的治疗指数(TI)分别为 6.98，7.88 和5.23.表 1 荔枝核总皂苷对 HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 的抑制率表 2 荔枝核总皂苷对 HepG2.2.15 细胞上清液中 HBV DNA 的影响 3 讨论近年来，一批中药和复方制剂经过实验研究及临床应用证实有一定的抗病毒作用. 国内党双锁等4报道，黄芪蛰虫合剂的各个实验浓度组均对 HepG2.2.15 细胞 HBsAg，HBeAg 及 HBV DNA的分泌有不同程度的抑制作用. 张晓刚等5用 HepG2.2.15 细胞研究白背叶根体外抗 HB
14、V 的活性，发现其对抑制 HepG2.2.15 细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg 的治疗指数分别为 13.26 和 43.08，对 HBV DNA 仅有微弱抑制作用. 欧阳雁玲等6研究了中药提取物人衔草对 HepG2.2.15 细胞作用 9 日的影响，发现其 200 mg/L 组对HBsAg 和 HBeAg 抑制率分别为 78.9和 35.58.国外有文献报道虎杖的 30 g/mL 乙醇提取物及水提取物在d 6 对 HBV DNA 的抑制率分别为 28.12和 48.127. Romero等8利用 HepG2.2.15 细胞作为细胞模型，通过药物作用细胞 21天后测定 HBsAg 和 HB
15、V DNA 评估药物作用，认为青蒿素及其衍生物青蒿琥酯在不产生细胞毒性的条件下，能够非常有效地抑制病毒产物.转基因 HepG2.2.15 细胞株载有 HBV 全基因组，能够进行病毒复制并稳定分泌感染性病毒颗粒及 HBsAg 和 HBeAg9. HBsAg 和 HBeAg 是 HepG2.2.15 细胞分泌到培养上清中的可溶性蛋白质，能够间接地反映病毒复制状况. 对 HepG2.2.15 细胞培养液中HBV DNA 及其抗原的动态分析表明10，细胞外 HBV DNA 水平与病毒抗原具有显著相关性，而细胞内 HBV DNA 水平与病毒抗原的相关性无统计学意义. 为此，我们选用 HepG2.2.15
16、 细胞培养上清中 HBV DNA 及其抗原的变化作为观察指标，以判定荔枝核总皂苷体外抗 HBV 作用. 我们利用 MTT 实验检测不同浓度荔枝核总皂苷对 HepG2.2.15 细胞的毒性作用，发现0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625 g/L 组在 d 6 对细胞的抑制率分别为53.7，39.3，26.0，12.6，11.0，7.93，6.0，4.0，随着药物浓度的增加，细胞抑制率呈上升趋势；除 0.8 g/L 组外，其他组对细胞的抑制作用均较弱.我们研究发现，荔枝核总皂苷的各个实验浓度组均能降低细胞培养上清中 HBsAg，HBeAg 及 HBV D
17、NA 的含量，且随时间的延长和药物浓度的增高，其作用也随之增强. 同时我们发现， 0.025 g/L 荔枝核总皂苷组在细胞毒性实验中对细胞的抑制与阴性对照组差异无统计学意义（P0.05 ），但在 d 6 上清液中的 HBsAg，HBeAg 及HBV DNA 含量与阴性对照组差异有显著统计学意义(P0.01)，在d 3 上清液中的 HBV DNA 含量与阴性对照组差异有统计学意义(P0.05)；而其他浓度组在两个时间段细胞培养上清中HBsAg，HBeAg 及 HBV DNA 的含量均和阴性对照组差异有显著统计学意义(P0.01)；0.4 g/L 荔枝核总皂苷组和 0.25 g/L 拉米夫定组对 HBsAg，HBeAg 及细胞外 HBV DNA 的分泌的抑制作用差异均无统计学意义（P0.05 ），二者在细胞毒性上差异也无统计学意义（P0.05） . 以上实验结果说明，在体外，荔枝核总皂苷具有和拉米夫定相似的抑制 HBV 的作用；而通过实验得出的治疗指数，我们认为荔枝核总皂苷对于体外抑制 HBV 属于有效低毒药物 . 那么荔枝核总皂苷是通过何种途径对体外 HBV 产生抑制作用，是诱导细胞产生抗病毒蛋白抑或抑制相关酶类、受体活性还是其他途径，其进一步机制尚待研究.【
