1、 环氧化酶2 抑制剂 Nimesulide 对膀胱癌T24 细胞体外生长的抑制作用作者：王勤章, 王蓉, 丁国富, 倪钊, 张国玺, 李应龙, 王新敏, 谢顺明【摘要】 目的 观察环氧化酶 2(COX2) 抑制剂Nimesulide(NIM)对人膀胱癌 T24 细胞株体外生长的影响，并探讨其作用机制。方法 采用细胞形态学、MTT 法、流式细胞术、吖啶橙溴化乙啶双染法（AO EB）等技术检测 NIM 对体外培养的人膀胱癌细胞株 T24 生长的抑制效应。结果 细胞形态学观察可见 NIM对 T24 细胞生长具有明显的细胞毒作用；MTT 法、流式细胞术分析显示 NIM 能明显抑制 T24 细胞的增殖，
2、且呈剂量、时间依赖关系；细胞周期分析表明，NIM 能使 T24 细胞 G0/G1 期细胞比例升高，S期和 G2/M 期细胞比例下降；流式细胞 DNA 直方图上出现典型的亚二倍体“凋亡峰 ”，细胞凋亡率与 NIM 作用时间和剂量相关；荧光显微镜检查显示 NIM 处理的 T24 细胞 AOEB 双染色后，细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光，典型细胞可见新月形改变，固缩或片段化的核。结论 COX2 抑制剂 NIM 对 T24 细胞生长具有明显的抑制作用，其作用机制可能与阻断细胞周期、诱导细胞凋亡等有关。 【关键词】 环氧化酶2；尼美舒利；T24 细胞株；体外作用The Inhibit Effect of
3、 the Cyclooxygenase2 Inhibitor Nimesulide on Human Bladder Cancer Cell Line T24 in VitroAbstract：Objective To investigate the growth effects of the selective cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide on human bladder cancer cell line T24 in vitro, and to clarify its probable mechanism.Methods The T24 cel
4、l line was culture in vitro, and exposed to a range of concentrations of Nimesulide at different time. The effect of COX2 inhibitor Nimesulide on the proliferation and apoptosis of human bladder cancer cell line T24 in vitro were observed by using cell morphology , MTT assay , flow cytometry, fluore
5、scent microscopy.Results Significant cytotoxicity of cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide on human bladder cancer cell line T24 were observed by cell morphology. MTT assay and flow cytometry show that cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide significantly inhibited cell proliferation of T24 cell line in
6、 vitro in a dose and timedependent manner .Cellcycle analysis by flow cytometry suggested that Nimesulide induced a decrease in S and G2/M phase population and a significant increase in G0/G1 population compared with untreated T24 cells. And a typical subdiploid peak before Phase G0/G1 was detected
7、by flow cytometry. The rates of apoptosis were correlated with the concentration of Nimesulide and time of action. A typical apoptosis morphology were also observed by fluorescent microscopy.Conclusion The selective cyclooxygenase2 inhibitor Nimesulide has significant inhibit effects on the growth o
8、f T24 cell, which is closely related to block cell cycle and apoptosisinducing.Key words：Cyclooxygenase2; Nimesulide; T24 Cell lines; In vitro0 引言 环氧化酶 2（Cycloooxygenase2,COX2）在肿瘤发生、发展中扮演重要角色，而近来发现其特异性抑制剂尼美舒利（Nimesulide，NIM ）有一定的抗肿瘤作用1。有关 NIM 对人膀胱癌细胞生长的影响鲜有报道。为此，我们以高表达 COX2 的膀胱癌细胞株 T24 为研究对象，观察 NIM
9、对 T24 细胞体外生长的影响，探讨 COX2 在膀胱肿瘤发病中的作用及其抑制剂的临床应用价值。1 材料与方法1.1 细胞系和主要试剂 T24 膀胱癌细胞株购自武汉大学典型培养物保藏中心。RPMI1640 培养基购自武汉亚法生物公司。小牛血清购自北京中山生物技术有限公司。NIM 购自深圳晶美公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、吖啶橙(AO)、溴化乙锭(EB) 染色液、二亚基亚砜(DMSO)等为 Sigma 公司产品。1.2 细胞培养及实验分组 T24 细胞用含 10%小牛血清的RPMI1640 培养基，在 37、5%CO2 培养箱中培养。取生长良好，接近融合的 T24 细胞，用 0.25%胰蛋白酶
10、消化，调整细胞密度，接种到不同培养板中，根据预实验结果，将 NIM 稀释成0、600、1200、1800、2400、3000mol/L 6 种浓度，过滤除菌。当细胞生长到对数生长期时，分别加入不同浓度的 NIM 使终浓度为0、30、60、90、120、150mol/L 处理 T24 细胞 48h，观察不同浓度NIM 对 T24 细胞的影响。用终浓度为 90mol/L NIM 处理 T24 细胞072h，观察不同作用时间对 T24 细胞的影响。1.3 细胞形态学观察 实验分组同上，在倒置显微镜下观察 T24 细胞用药前后的形态变化。1.4 细胞生长抑制率测定 使用四唑盐比色法（MTT）检测细胞存
11、活率，按以下公式计算细胞抑制率： 细胞抑制率（% ） =（1实验组 OD 值/对照组 OD 值）100%1.5 流式细胞分析 收集不同浓度 NIM 作用后 T24 细胞及 90mol/L 浓度 NIM 处理后 T24 细胞，用流式细胞仪及细胞分析软件检测凋亡细胞数，同时分析细胞周期。 1.6 荧光显微镜检测 采用 AOEB 双染法染色，在荧光倒置显微镜下观察以下4 种细胞：含正常核的活细胞(VN，绿色染色质，结构正常) ；含凋亡核的活细胞(VA ，绿色染色质，高度聚集或断裂) ；含正常核的死细胞(NVN，橘红色染色质，结构正常)；含凋亡核的死细胞(NVA，橘红色染色质，高度聚集或断裂)。1.7
12、 统计学方法 使用 SPSS10.0 统计分析软件包处理，比较采用方差分析、配对 t 检验，P0.05 为有统计学意义。2 结果2.1 NIM 干预后 T24 细胞形态学观察 24h 药物30、60mol/L 组部分细胞形态失常，胞体变圆和不规则、脱壁，细胞间接触变松，胞浆中颗粒增多，增殖变慢，一些细胞死亡；90、120、150mol/L 组则有较多细胞出现上述改变，并可见部分癌细胞死亡从板上脱落。72h 药物 30、60mol/L 组多数细胞形态改变，较多细胞脱落，漂浮于培养基中；90、120、150mol/L 则可见大片死亡细胞及大量细胞碎屑，对照组细胞无形态学改变，呈上皮型贴壁生长，细胞
13、轮廓清晰，细胞间接触紧密，细胞生长旺盛，见图1。2.2 NIM 干预后对 T24 细胞增殖的影响 MTT 法检测结果显示 T24 细胞的生长受到明显的抑制，且此抑制作用与药物浓度和作用时间均呈明显的依赖关系，见表 1。2.3 NIM 对 T24 细胞凋亡和细胞周期影响的流式细胞仪分析 流式细胞仪检测发现在 DNA 直方图上，对照组 G0/G1 峰前有离散的低 DNA 含量的弥散峰；而实验组 G0/G1 峰前有明显的凋亡峰，且随着 NIM 浓度增加，凋亡细胞数逐渐增多，见表 2。用 90mol/L NIM 处理 T24 细胞 0 72h 发现，随 NIM 处理时间的延长，凋亡细胞数也逐渐增多,见
14、表 3。同时发现，随 NIM 作用浓度的增加和作用时间的延长，G0/G1 期细胞逐渐增多，且 G0/G1 期细胞的增多与NIM 诱导 T24 细胞凋亡率呈正相关（ r=0.68，P0.05）。表明NIM 对 T24 细胞凋亡的诱导及生长表 1 NIM 对 T24 细胞增殖的抑制率（略）注：同一浓度不同时间比较*P0.05，不同浓度同一时间比较#P0.05 的抑制主要发生在细胞周期的 G0/G1 期，见图 2。表 2 NIM 对 T24 细胞凋亡和细胞周期的影响（略）注：不同浓度实验组与对照组比较*P0.05，*P0.01表 3 不同作用时间 NIM（90mol/L）对 T24 细胞凋亡和细胞周
15、期的影响（略）注：不同作用时间实验组与对照组比较*P0.05，*P0.01A.未加药组;B.150mol/L48h 组图 2 N1M 对 T24 细胞凋亡和细胞周期影响的流式细胞仪分析（略）2.4 NIM 对 T24 细胞凋亡的荧光染色观察 结果显示，NIM 处理的 T24 细胞染色后，凋亡细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光，典型细胞可见新月形改变，固缩或片断化的核，而正常细胞核呈弥散均匀、较弱的荧光，见图 3。3 讨论 我们前期试验结果及一些研究报道也证实，膀胱肿瘤细胞可高表达 COX2，而正常膀胱粘膜表达量很低 2。因此，通过阻断 COX2 表达，抑制其活性，破坏其对肿瘤的生长调节，对膀胱肿瘤
16、临床治疗的重要意义值得深入研究。 我们以高表达COX2 的膀胱癌 T24 细胞为研究对象，选择临床广泛使用的COX2 特异性抑制剂 NIM 对其体外生长进行干预，通过采用不同方法，从多角度观察发现，NIM 在体外可显著抑制 T24 细胞增殖，其抑制作用主要体现在阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，并呈现剂量和时间依赖性，但其具体作用机制不详。Grosch 等3 研究认为COX2 抑制剂阻滞细胞周期可能涉及cyclinA、cyclinB1、p21WAF1、p27KIP1 的参与。Hsu 等4研究则表明，COX2 可能对癌细胞具有凋亡保护作用，COX 2 抑制剂诱导的凋亡效应与 COX2 表达水平有相关性
17、，而 Akt 活性的抑制可能在 COX2 抑制剂诱导的凋亡中起决定性作用，但有待进一步的研究。 我们的研究结果初步表明，COX2 特异性抑制剂NIM 在体外可通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡对 T24 细胞生长产生明显的抑制作用，提示 COX2 可能是一种促进细胞增殖并抑制细胞凋亡的新基因，在基因水平或蛋白水平下调 COX2 表达或抑制活性，可有效地抑制膀胱癌细胞的增殖，并从根本上失去对凋亡的抗拒力，而变得易于发生凋亡，COX2 可作为新的靶分子有助于基因治疗或设计新的药物治疗膀胱癌。而作为 COX2 特异性抑制剂，由于 NIM 能高度选择性抑制与 PGs 合成有关的 COX2 的活性，而不影响胃、肾等器官的生理性 PGs 合成有关的 COX1 的活性，从根本上解决了以往解热镇痛类药物对胃肠道的刺激与对肾功能的损害5，因此更具可用性，NIM 作为膀胱癌的凋亡诱导剂亦有着良好的临床应用前景。【
