1、环氧化酶 2 抑制剂预防大鼠化学性乳腺癌【摘要】目的：观察环氧化酶 2(COX 2) 选择性抑制剂塞来昔布对化学致癌剂 7，12 二甲基苯蒽（DMBA）化学诱发的大鼠乳腺癌形成的影响.方法：DMBA 油剂灌胃复制大鼠乳腺癌模型， 90 只大鼠分为 3 组，单纯诱癌组作为阴性对照、三苯氧胺组作为阳性对照、观察塞来昔布对大鼠乳腺肿瘤发生率和 bcl 2,VEGF 蛋白表达的影响.结果：三苯氧胺组（48.2%）和塞来西布组（50.0% ）肿瘤发生率低于单纯诱癌组（85.7%，分别为 P=0.003，P=0.004）.塞来昔布组 VEGF 蛋白表达率（42.9%）低于单纯诱癌组（79.2%，P=0.0
2、23），和三苯氧胺组（46.2%）无差异（P=0.863）.塞来昔布组 bcl 2 蛋白表达率（42.9%）低于单纯诱癌组（83.3%，P=0.010 ），低于三苯氧胺组（53.9% ），但无差异（P=0.568）.结论：塞来昔布能抑制 DMBA 诱发的大鼠乳腺癌的发生、发展，下调 bcl 2 和 VEGF 蛋白表达可能是其机制之一. 【关键词】乳腺肿瘤化学预防三苯氧胺塞来昔布环氧化酶 2 0 引言 环氧化酶(cyclooxygenase，COX)参与维持机体各种生理和病理过程.COX 1 是一种结构酶，它催化产生的 PG 参与机体正常生理过程和保护功能，COX 2 被认为是诱导型酶，只在病理
3、情况下才表达，包括炎症、损伤、修复及肿瘤的生长和转移.许多癌前病变和恶性肿瘤均有 COX 2 基因扩增和蛋白的高表达，有效抑制 COX 2 的表达可能对肿瘤发生、发展具有重要意义1-2.本研究在用化学致癌 剂7，12 二甲基苯蒽(7，12 dimethylbenzanthracene ，DMBA)诱发大鼠乳腺癌的过程中，观察 COX 2 特异性抑制剂塞来昔布对 DMBA 化学诱发的乳腺癌形成及 bcl 2 及 VEGF 蛋白表达的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 实验用未交配雌性 SD 大鼠 90 只，鼠龄（455 ）d，体质量（11010）g，以 DMBA 油剂 200mg/kg 灌胃复
4、制大鼠乳腺癌模型.每组 30 只大鼠，分为单纯诱癌组（造模后正常饮食）作为阴性对照、三苯氧胺组（饮用水加入 4mg/kg 三苯氧胺，正常饮用）作为阳性对照、塞来昔布组（饲料加入 1000mg/kg 塞来昔布，用玉米油溶解后，拌于正常饲料内喂养）.观察各组大鼠进食、毛发、排泄情况，并每周两次检测大鼠乳腺. 1.2 方法 于实验的第 120 日停药，经阴道涂片检查，证实为间情期，以50g/L 乌拉坦液腹腔注射麻醉，将每个乳腺连同周围皮肤、皮下组织解剖，自乳头部对半切开乳腺进行大体观测，计数肿瘤数量及形态，标本固定于 40g/L 甲醛 溶液中，常 规石蜡包埋，HE 染色.乳腺癌诊断参考实验性大鼠乳腺
5、癌分类诊断标准3. 免疫组化 SP 法 检测 bcl 2 和 VEGF 蛋白表达：4m 石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精水化，30g/LH2O2 甲醇室温下封闭，微波炉修复抗原，非免疫性羊血清以阻断组织中非特异性吸附，滴加兔抗鼠 bcl 2，VEGF 多克隆抗体(1 100)，湿盒内 4冰箱过夜，滴加生物素标记的二抗 IgG，滴加辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液，DAB 显色，苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片.以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性，阳性判定标准：无阳性染色；，弥散弱的胞浆染色，染色细胞数10； ，中等至强的胞浆染色，阳性细胞数介于 1050； ，50以上的细胞强染色.
6、统计学处理：统计学检验采用 SPSS10.0 软件进行，P0.05 为有显著性差异. 2 结果 实验结束前死亡大鼠未纳入实验结果统计，实验结束时每组有完整数据的大鼠数为：单纯诱癌组 28 只，三苯氧胺组 27 只，塞来昔布组 28 只. 2.1 单纯诱癌组、三苯氧胺组和塞来昔布组乳腺癌发生率 单纯诱癌组 24 只大鼠发生乳腺癌，发生率为 85.7（24/28 ）；三苯氧胺组 13 只大鼠发生乳腺癌，发生率 48.2%（13/27）；塞来昔布组14 只大鼠发生乳腺癌，发生率 50.0（14/28）；三苯氧胺组、塞来昔布组乳腺癌发生率低于单纯诱癌组(28.811，P=0.003 ；28.187，P
7、=0.004) ；三苯氧胺 组与塞来昔布组的乳腺癌发生率无显著性差异(20.019，P=0.891). 2.2VEGF 蛋白在乳腺癌 组织中的表达 VEGF 蛋白的阳性染色 颗粒位于乳腺癌细胞的胞浆内，部分内皮细胞可见阳性着色，塞来昔布组（图 1A）与 单纯诱癌组（图 1B）比较，VEGF 蛋白的表达明显 减弱.VEGF 蛋白在 3 组肿瘤组织中的表达为，3 组之间阳性表达率差异有统计学意义(2=6.457，P=0.040)；塞来昔布组 VEGF 蛋白阳性表达率低于 单纯诱癌组 ，差异有统计学意义（2=5.179，P=0.023）；塞来昔布组 VEGF 蛋白阳性表达率与三苯氧胺组无统计学差异（
8、2=0.030 ，P=0.863）.三苯氧胺组和单纯诱癌组VEGF 蛋白阳性表达率有 统计学差异（2=4.194，P=0.041，表 1）.表1VEGF 和 bcl2 蛋白在单纯诱癌组、三苯氧胺组、塞来昔布组乳腺癌组织中的表达(略) 2.3bcl 2 蛋白在乳腺癌 组织中的表达 bcl2 蛋白的阳性染色颗粒位于乳腺癌细胞的胞浆内，部分内皮细胞可见阳性着色，塞来昔布组（图 2A）与单纯诱 癌组（图 2B）比较，bcl 2 蛋白的表达明显减弱.bcl 2 蛋白在 3 组肿瘤组织中的表达为，塞来昔布组 bcl 2 蛋白阳性表达率低于单纯诱 癌组，差异有统计学意义（2=6.705，P=0.010）；塞
9、来昔布组 bcl 2 蛋白阳性表达率与三苯氧胺组无统计学差异（2=0.326 ，P=0.568）；三苯氧胺组 bcl 2 蛋白阳性表达率低于单纯诱癌组，但无统计学差异（2=3.718，P=0.054,表 1）. 3 讨论 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，三苯氧胺是乳腺癌预防和治疗的一线用药和金标准.许多癌前病变和恶性肿瘤中均有 COX 2 基因的扩增和蛋白的高表达，有效抑制 COX 2 的表达对预防肿瘤发生发展有重要意义.本研究采用三苯氧胺作为阳性对照，在大鼠化学性乳腺癌的发生过程中，观察塞来昔布对大鼠乳腺癌形成的影响，并探讨其抗肿瘤形成的机制. 本研究发现，塞来昔布组乳腺肿瘤发生率明显低于
10、单纯诱癌组，表明塞来昔布能有效抑制 DMBA 诱发的大鼠化学性乳腺癌的 发生、发展，对乳腺癌高危人群预防具有潜在的应用价值.其他学者也有类似报道，Harris 等4用塞来昔布 处理 DMBA 诱导的乳腺癌模型，发现塞来昔布能明显延迟肿瘤的发生，与优布芬相比更加有效.饲料内混入塞来昔布乳腺癌的发生率，多发率及肿瘤体积，较对照组低. COX 2 参与肿瘤的发生发展的机制尚不完全清楚，可能包括：刺激增殖、抑制凋亡、抑制免疫机能、参与前致癌物的代谢等途径.COX 2过度表达可剌激肿瘤新生血管的形成，但其机制尚未完全明确，其直接产物 PGE2 能直接刺激血管生成；同时，PGE2 能诱导组织生成 VEGF
11、，产生的 VEGF 以旁分泌和自分泌的形式作用于内皮 细胞，从而促进血管形成.本研究发现，在塞来昔布处理的肿瘤组织中，VEGF 蛋白的表达水平明 显低于单纯诱癌组 ，表明作为 VEGF 的上调因子，抑制 COX 2 的表达和活性可明显下调 VEGF 的表达，两者具有明显的相关性.人结肠癌细胞株转染 COX 2 基因发现肿瘤细胞在过度表达 COX 2 的同时促血管生成因子 VEGF,bFGF,PDGF,内皮素等均明显上调,并促进人脐静脉内皮细胞株增殖并形成网状的内皮细胞条索5.Chang 等6的研究也认为 COX 2诱导的乳腺癌发生发展和 PGE2 依赖的的肿瘤新血管生成关系密切.谯敏等7发现以
12、COX 2为靶向的 RNA 干扰显著抑制胃癌细 胞生长,可能与下调COX 2 基因表达和诱导细胞凋亡有关，这些均说明 COX 2 能刺激肿瘤新血管生成，而下调 VEGF 表达是特异性 COX 2 抑制剂塞来昔布的抗肿瘤机制之一. Celecoxib 抑制细胞凋亡的机制还不完全清楚，包括增加 bcl 2表达、减弱 NO 信号途径和阻断 AKT 磷酸化等途径 .bcl 2 是主要的抗凋亡和抗氧化蛋白，COX 2 可上调 bcl 2 蛋白表达，同时下调凋亡蛋白 bax 和 bcl XL 的表达8.本研究发现 塞来昔布处理后的肿瘤组织细胞的 bcl 2 表达在蛋白水平上明显低于 对照组，差异具有显著性
13、，表明通过下调 bcl 2 的表达、 诱导凋亡产生是塞来昔布的抗肿瘤机制之一. 我们的研究表明，选择性 COX 2 抑制剂塞来昔布可以有效预防大鼠乳腺癌的发生，机制可能与下调 VEGF 和 bcl 2 蛋白表达有关. 【参考文献】 1MasferrerJL,LeahyKM,KokiAT,etal.Antiangiogenicandantitumoractivitiesofcyclooxygenase 2inhibitorsJ.CancerRes,2000,60(5):1306-1311. 2刘江伟，李开宗，窦科峰，等 .胰腺癌 组织 survivin 和COX 2 表达的相关性J.第四军医大学
14、学报,2004,25(7):635-636. 3RussoJ,RussoI.AtlasandhistologicclassificationoftumorsoftheratmammaryglandJ.JMammaryGlandBiolNeoplasia,2000,5(2):187-200. 4HarrisRE,AlshafieGA,Abou IssaHM,etal.Chemopreventionofbreastcancerinratsbycelecoxib,acyclooxygenase2inhibitonJ.CancerRes,2000,60(8):2101-2103. 5TsujiiM,K
15、awanoS,TsujiS,etal.CyclooxygenaseregulatesangiogenesisinducedbycoloncancercellsJ.Cell,1998,93(5):705-716. 6ChangSH,LiuCH,ConwayR,etal.RoleofprostaglandinE2 dependentangiogenicswitchincyclooxygenase2 inducedbreastcancerprogressionJ.ProcNatlAcadSciUSA,2004,101:591-596. 7谯敏，向廷秀，王丕龙，等 .靶向 COX 2 的 siRNA 抑制三种不同分化程度胃癌细胞生长及作用机制J.第四军医大学学报,2006,27(14):1318-1321. 8ShimizuD,VallbohmerD,KuramochiH,etal.Increasingcyclooxygenase 2(cox 2)geneexpressionintheprogressionofBarrett sesophagustoadenocarcinomacorrelateswiththatofBcl 2J.IntJCancer,2006,119(4):765-770.
