1、 苦参碱对 HL-60 细胞增殖与分化影响的实验研究作者：李玉红，许浪，晏丹，刘丹【摘要】 目的观察苦参碱对 HL-60 细胞增殖和分化的影响作用。方法以 HL-60 细胞为实验对象, 采用体外培养技术, 通过 MTT法测细胞活力、细胞周期分析、细胞凋亡检测、硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验、细胞表面分化抗原检测等方法来观察不同浓度苦参碱对 HL-60 细胞的作用。结果浓度为 12.5 50 g/ml 的苦参碱能明显抑制 HL-60 细胞的增殖，使细胞周期发生改变，G0/ G1 期细胞增多，S 期细胞减少，凋亡细胞明显增多，对 NBT 的还原能力增强，细胞表面分化抗原 CD11b 和 CD15
2、表达增加。结论苦参碱对白血病细胞具有一定的抑制增殖、诱导凋亡和诱导分化作用，对白血病的治疗提供有力的实验依据。 【关键词】 苦参碱； HL-60 细胞； 增殖； 分化苦参碱 (matrine, MAT)是传统中药苦参的有效成分, 研究报道苦参碱类药具有显著抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤分化和凋亡、抗肿瘤浸润和远处转移、抑制肿瘤新生血管形成、减轻肿瘤炎症和抑制肿瘤耐药性、减低化疗不良作用、增强肿瘤宿主免疫等功能1。本实验观察苦参碱对 HL-60 细胞增殖与分化方面的影响，并对其作用机制进行初步探讨，以期对白血病的治疗提供一些新的思路。1 材料与方法 1.1 细胞系和主要试剂 HL-60 细胞系为武汉大学
3、流行病学实验室所赠，苦参碱购于广州明兴制药有限公司，用 RPMI1640 培养基稀释，过滤除菌保存 , 临用时用适量的培养基稀释至实验所需浓度。RPMI1640 培养基为 GIBCO 公司产品，硝基四氮唑蓝(NBT) 为上海前进化学试剂厂产品，PE 标记的小鼠抗人CD11b 单抗和 FITC 标记的小鼠抗人 CD15 单抗购于晶美生物工程有限公司。1.2 细胞培养及苦参碱处理 HL-60 细胞培养于含 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养基中。置 37 、饱和湿度的 5 %CO2 孵箱中培养，23 d 换液传代 1 次，取对数生长期的细胞进行实验，实验细胞起始接种浓度为 1 105 /m
4、l。将细胞分为 4 组，分别加入苦参碱使其终浓度为 0（对照组），12.5， 25，50 g/ml 进行后续观察。1.3 MTT 法检测细胞活力台盼蓝染色记数活细胞95%后，将细胞转入 96 孔培养板培养，每孔加入用不同浓度的苦参碱处理72 h 的细胞悬液 200 l，设重复孔 3 个，向各孔中加入 20 l 的 MTT(5 mg/ml)溶液， 37, 5%CO2 培养箱孵育 4 h 后，终止培养，平板离心弃上清，每孔加 100 l DMSO，微量振荡器振荡 10 min，使结晶物充分融解，显微镜观察至甲臜充分溶解后， 用国产DG3022 型酶标仪测各孔在波长 570 nm 和 630 nm
5、处的 OD 值， 将 OD570 减去 OD630 即为测定结果。1.4 细胞周期分析分别收集上述经不同浓度苦参碱处理 72 h的 HL-60 细胞，离心 5 min，弃上清液，PBS 洗涤两次, 每份样品加 RNase 100 l，PI ( 含 0.1%Triton-X100)300 l 单染 30 min，37避光保存，经流式细胞仪检测细胞周期时相分布，上机时 300 目尼龙网滤过，计数 10 000 个细胞。1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡率分别收集上述经不同浓度苦参碱处理 72 h 的 HL-60 细胞，离心 5 min，弃上清液，PBS 液洗涤细胞两次。用结合缓冲液将细胞浓度调整为 1
6、106/ml，取 100 ml，加入 5 l Annexin V 和 10 l PI 溶液，混匀，室温避光孵育 15 min后加入 400 l 缓冲液，上机检测。正常活细胞为: Annexin V（-）/PI（-），早期凋亡细胞: Annexin V（+）/PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞: Annexin V（+）/PI（+ ），机械性损伤细胞 : Annexin V（- ）/PI（+）。1.6 NBT 还原能力测定分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72 h 的 HL-60 细胞，离心 5 min，弃上清液，PBS 液洗涤细胞两次，调整细胞浓度为 1106 细胞，加 0.5 ml 含 0.1
7、NBT 及 200 ng/ ml鞣酸(TPA)的生理盐水，37保温 60 min，离心弃上清，将沉淀细胞均匀涂片，Wright-Giesma 染色，油镜下计算阳性细胞数。1.7 细胞表面分化抗原检测分别收集上述经不同浓度苦参碱处理 72 h 的 HL-60 细胞， 离心 5 min，弃上清液， PBS 液洗涤细胞两次，调整细胞浓度为 1106 细胞，分别加入 PE 标记的小鼠抗人 CD11b 单抗、FITC 标记的小鼠抗人 CD15 单抗 1 ml，混匀后避光反应 20 min, 用 PBS 洗液洗涤，离心，加 0.5 ml PBS 洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。2 结果2.1 苦参碱对 HL
8、-60 细胞的生长抑制如图 1 所示，苦参碱对HL-60 细胞生长抑制作用呈浓度依赖性，12.5 g/m l 的苦参碱显示具有明显抑制作用，随着浓度的增加其抑制作用进一步增强，与对照组有明显差异。2.2 苦参碱对 HL-60 细胞周期影响流式细胞仪检测不同浓度苦参碱作用 HL-60 细胞 72 h 后的细胞周期分布，各期细胞比例见表 1。苦参碱处理 72 h 后与对照组比较，G0/ G1 期细胞增多，S 期细胞明显减少，提示苦参碱可阻止 HL-60 细胞由 S 期向 G2/ M 期的进程，阻滞细胞的有丝分裂，使细胞发生 S 期阻滞，且随苦参碱浓度增加，G0/ G1 期细胞增多和 S 期细胞减少
9、越明显(P 0.01) 。表 1 不同浓度苦参碱作用 72 h 后 HL-60 细胞周期分布（略）2.3 苦参碱对 HL-60 细胞凋亡的影响 Annexin V -FITC /PI 双染法 FCM 检测显示, 不同浓度苦参碱作用 72 h 对 HL-60 细胞凋亡率 Annexin V（+）/PI（-）的影响(n=3)见表 2。如表 2 所示，不同浓度苦参碱作用后，细胞凋亡率明显高于空白对照组(P0.01)，且随着浓度的增加，凋亡率从 15.24%增加到 33.43%。表 2 各浓度苦参碱作用 72 hHL-60 细胞凋亡率（略）2.4 苦参碱对 HL-60 细胞 NBT 还原能力的影响成熟
10、粒细胞在波佛酯的激发下能使可溶性淡黄色 NBT 还原为不溶性蓝紫色沉淀，沉积于细胞质内，未分化细胞呈 NBT 反应阴性，计算阳性细胞可间接反映细胞分化成熟程度。未经药物处理的细胞 NBT 反应呈阴性，不同浓度的苦参碱可使 HL-60 细胞对 NBT 产生不同的还原能力，以 25 g/ml 浓度 NBT 阳性率最高，（见表 3）。各药物组与对照组有明显差异。表 3 苦参碱对 HL-60 细胞 NBT 还原能力的影响（略）2.5 苦参碱对 HL-60 细胞表面分化抗原还原 CD11b、CD15的影响对照组 HL-60 细胞能表达一定量的表面抗原CD11b、CD15，不同浓度苦参碱处理 72 h 后
11、，HL-60 细胞表面抗原CD11b、CD15 都出现一定程度的增加，如图 2 所示。3 讨论 急性白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病。研究发现多种化疗药物都可以诱导白血病细胞凋亡。但传统化疗药物具有非常大的毒副作用, 因此中药抗肿瘤的研究具有非常重要的意义。人们认识到苦参的抗肿瘤作用已有多年，对苦参碱的诱导分化作用也进行了初步的研究。本文就苦参碱在急性早幼粒细胞性白血病方面的作用进行初步探索。 恶性肿瘤的治疗我们一般从 3 个方面考虑：抑制增殖，诱导凋亡，诱导分化。苦参碱对多种肿瘤细胞具有抑制增殖作用，其通过将肿瘤细胞阻滞于特定的细胞周期，从而抑制细胞的过度增殖。研究表明，苦参碱可以将不同的
12、肿瘤细胞阻滞在不同的细胞周期，如 G0/Gl 期、S 期、G1 期等。如苦参碱可使体外培养的HeLa 细胞增殖抑制，且随着浓度的增强更为明显，同时使细胞周期改变，G0/Gl 期比例增高2。本研究也发现不同浓度苦参碱可抑制 HL-60 细胞的增殖，50 g/ml 苦参碱处理 72 h 后活细胞数目下降至 2105/ml，与此同时我们观察到随着苦参碱浓度的增加，HL-60细胞周期也发生一定的变化，G0/Gl 期细胞比例增高，S 期、G2/M 期细胞比例明显减少。认为苦参碱抑制 HL-60 细胞增殖与细胞周期的变化息息相关。苦参碱对 HL-60 细胞的细胞周期阻滞作用可能是通过调控一些细胞因子的表达
13、而产生的。已有研究发现苦参碱可以下调视网膜母细胞瘤细胞株 HXO-Rb44 细胞的增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuelear antigen，pCNA)PCNA 表达，从而使细胞增殖受到抑制3，由此可见，苦参碱将肿瘤细胞阻滞于不同细胞周期的分子机制可能是苦参碱在基因水平上调控一些细胞因子如PCNA 等的表达。 近年研究表明苦参碱可以引起多种肿瘤细胞凋亡4，本研究发现低浓度(12.5 g/m l) 的苦参碱已经明显诱导HL-60 细胞凋亡，随着苦参碱浓度增加，凋亡细胞也逐渐增加。苦参碱诱导细胞凋亡的途径比较复杂，可能与多个凋亡相关基因的表达变化有关。 HL-60 细胞
14、在不同分化诱导剂的作用下可以向粒系或单核细胞系分化的过程中，它的细胞表面分化抗原也相应发生改变。其中，CD11b 和 CD15 是髓系最主要的表面分化抗原，根据二者的表达变化可较准确地判断 HL-60 细胞的分化成熟程度。许多研究表明，当 HL-60 细胞向粒系成熟分化时，其 CD11b 和 CD15 的表达会相应升高5，6。另外当 HL-60 细胞在分化诱导剂的作用下向成熟细胞分化时 HL-60 细胞 NBT 还原能力也会发生明显改变。本研究中我们通过观察苦参碱处理 72 h 的 HL-60 细胞，发现其表面分化抗原 CD11b 和 CD15 表达明显增加，NBT 还原实验发现不同浓度苦参碱能使 HL-60 细胞还原能力明显增加，但是 25 g/ml 和 50 g/m l 苦参碱对 HL-60 细胞的 NBT 还原能力影响差别不大。 本研究证实，苦参碱对白血病细胞的增殖具有明显的抑制作用，能促进白血病细胞凋亡，并能诱导白血病细胞从功能上向成熟细胞分化。说明苦参碱具有抗白血病的作用, 可能是通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡实现的。至于苦参碱对 HL-60 细胞抑制增殖和诱导分化作用的具体机制还需要我们进一步的探索。【
