1、 苦参碱对宫颈癌 Hela 细胞的作用【摘要】 目的: 观察不同浓度的苦参碱对宫颈癌 Hela 细胞的作用。方法: 浓度分别为 0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml的苦参碱体外培养 Hela 细胞 24h、48h、72h 后，分别用 MTT 法观察苦参碱对 Hela 细胞的生长抑制作用、 AnnexinV-PI 双标染色用流式细胞仪检测苦参碱对 Hela 细胞凋亡的影响。结果：不同浓度的苦参碱具有抑制宫颈癌 Hela 细胞增殖的作用，呈明显的时间、剂量依赖性。各浓度和时间之间比较具有显著差异性（P0.01）。FCM检测结果显示苦参碱作用后，细胞的凋亡率增加，呈
2、现随时间和剂量依赖性。各浓度和时间之间比较也具有显著差异性（P0.01）。结论：苦参碱对人宫颈癌 Hela 细胞的增殖具有明显的抑制作用，能诱导肿瘤细胞的凋亡。 【关键词】 苦参碱; 凋亡苦参是临床常用的中药之一，是豆科植物苦参 Sophora Flavescens Ait 的干燥根，苦参碱类生物碱是从苦参（sophora flavescens ait）提取的具有广泛药理作用的活性物质1。近年研究苦参碱能抑制很多肿瘤的增殖和导致其肿瘤细胞的凋亡，在胃癌细胞 SGC79012、口腔上皮癌 KB 细胞3、大肠癌HT 29 细胞4和结肠癌 SW1116 细胞5中已做了大量的实验进行凋亡机制的研究，但
3、是对宫颈癌 Hela 细胞的研究还未见报道。本实验旨在研究苦参碱抑制宫颈癌 Hela 细胞增殖和导致其凋亡的作用，探讨其对宫颈癌可能的作用机制。1 材料与仪器1.1 主要试剂 苦参碱注射液（商品名：永新）0.15g/支，购自扬子江药业集团有限公司，产品批号 ：05110501；RPMI 1640 培养基和胰酶（EDTA），美国 Gibco 公司产品；新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，噻唑蓝(MTT)染液为北京中山公司产品；Annexin VFITC/PI 凋亡检测试剂盒，Bender Medsystem 公司产品，晶美生物工程有限公司代理。1.2 仪器设备 超净工作台，细胞培养箱
4、（HG3033K）；倒置显微镜 OLYMPUS；流式细胞仪（Coulter Epics XL），酶联免疫监测仪（BioRad 550）。1.3 细胞株 宫颈癌 Hela 细胞株由武汉大学医学院病毒研究所伍星欣教授馈赠。2 方法2.1 体外细胞培养 Hela 细胞培养于含 10新生小牛血清、100U/ml 青霉素、 100mg/l 链霉素的 RPMI1640 培养基中，置于 5CO2、37、 95%饱和湿度的恒温密闭孵箱中进行常规培养，每日观察细胞的生长情况。23 天传代一次。2.2 MTT 法检测细胞生长抑制率 取对数生长期的 Hela细胞，0.02EDTA 消化、计数，以 1l05 个细胞/
5、 毫升悬液 200ul/孔接种于 96 孔培养板，24h 后加入质量浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml 经生理盐水稀释的苦参碱（ Mat）,对照组仅加生理盐水。孵育 24、48、72h 后换无血清的培养基加 MTT20ul继续培养,4h 后弃去培养基，每孔加二甲基亚砜 200ul/孔，振荡10min，在全自动酶标仪上选择波长 490nm 测定吸光值（A 值），计算各组细胞的生长抑制率。 细胞抑制率=（1-实验组 A/对照组A）100，计算细胞抑制率。实验重复 3 次，每次、每浓度、每时段均设 6 个复孔。2.3 AnnexinV FITC/PI 双标染色，流式细胞仪测定 Hel
6、a 细胞的调亡率 收集不同浓度（0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml）、不同时间（24、48、72h）苦参碱处理后的细胞，EDTA 消化，收集 1106细胞，1000r/min 离心 5min，弃上清，用 4预冷的 PBS 洗细胞，1000r/min 离心 5min 弃上清，共两次。用 250ul 结合缓冲液重新悬浮细胞。取 100ul 细胞悬浮于 5ml 流式管中，加入 5ulAnnexin V/FITC 和 10ul20ug/ml 的 PI，混匀后避光孵育 15min，在反应管中加 400ulPBS，流式细胞仪（FCM ）分析凋亡。2.4 统计学处理 数据采用 SPSS13.0 统计软
7、件分析，采用但因素方差分析进行比较，结果采用s 表示， P0.05 具有统计学意义。3 结果3.1 苦参碱对宫颈 Hela 细胞增殖抑制作用 苦参碱以时间剂量依赖方式抑制细胞的增殖。0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml 的苦参碱对细胞均有明显的抑制作用，且随着培养液中苦参碱的浓度增加和培养时间的延长，抑制作用逐渐增强，呈现时间、浓度依赖性。统计学结果显示不同时间之间具有显著差异性（P0.01），各浓度之间也存在显著差异性（P0.01）。表 1 不同浓度苦参碱作用 Hela 细胞不同时间的吸光度及抑制率（略）注：* 不同时间比较，P0.05。 苦参碱组（0.5mg/ml、1.0mg/ml、1
8、.5mg/ml、2.0mg/ml）浓度、不同时间（24h、48h、72h）组对宫颈癌细胞的增殖均具有明显的抑制作用(P0.01),随着浓度的增加，时间的延长，抑制率随之加大，存在浓度、时间的依赖关系。3.2 AnnexinV PI 双标染色流式细胞仪分析苦参碱对 Hela 细胞凋亡的影响 不同浓度的苦参碱作用 Hela 细胞 24、48、72h后，细胞凋亡发生率明显增高，随苦参碱浓度加大和作用时间延长，凋亡率明显增高，与对照组相比具有显著差异性。表 2 苦参碱作用宫颈癌 Hela 细胞流式检测凋亡率（略）苦参碱诱导人宫颈癌 Hela 细胞具有明显的药物浓度依赖性，在同一时间段，随药物浓度的增加
9、细胞凋亡率增加，两者呈正相关（P0.01）。同一浓度不同时间段（24h、48h、72h）细胞的调亡率逐渐增加。2mg/ml 浓度苦参碱作用 72h 后的调亡率最高，为24.4。4 讨论 宫颈癌威胁全世界妇女健康的严重疾病，在我国它一直居妇科恶性肿瘤首位。宫颈癌的治疗主要是手术治疗为主、放化疗为辅的治疗方法，治疗的费用较高，效果也不理想。同时，手术的创伤和化疗的副作用也在一定程度上影响着患者的生活质量。现在传统的中药治疗已成为治疗肿瘤的一个途径，有关苦参碱类抗肿瘤集中的研究目前已成为抗癌中药研究的一个热点。苦参碱类作为一种传统的中药成分，在抗炎、抗心律失常、抗过敏、平喘、镇痛和抗病毒方面有很大的
10、影响，有研究苦参碱对人乳头瘤病毒有抑制作用，在最近的研究结果表明苦参碱对于肿瘤的防治也有很大的影响68。在肿瘤的分子生物学研究中，肿瘤的发生机制有很多，但细胞凋亡始终是学术界的研究热点。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，凋亡是通过启动其自身遗传机制，内源性 DNA 内切酶的激活，而发生自动死亡的过程，具有特定的形态学特征和生化标记。在生理状态下，机体通过凋亡途径清除体内衰老和异常细胞，维持机体组织的动态平衡。而对于肿瘤，如凋亡过程受抑制，将促使细胞恶性增生。 我们通过体外实验证实，经苦参碱作用后的 Hela细胞的形态发生了改变，细胞由原来的多边形，形态饱满变成细胞变圆，体积缩小。MTT 实验证实，苦参碱能够抑制人宫颈癌 Hela细胞株的生长，其抗增殖的效应存在时间剂量的依赖性。肿瘤细胞凋亡的机制有很多，目前的研究发现导致肿瘤的发生除了经典的Bcl2 蛋白过表达直接或间接抑制了凋亡以外9，另外一组调节凋亡分子在 1993 年 Crook10为了鉴定病毒感染的调节子过程中被从杆状病毒中发现，即凋亡蛋白抑制剂(inhibitot of apoptosis proteins， IAPs)家族。从流式细胞仪的结果我们可以发现，苦参碱能诱导 Hela 细胞的凋亡，随着苦参碱浓度和时间的增加，细胞的凋亡逐渐增多。但是苦参碱具体诱导人宫颈癌细胞凋亡作用的具体机制，还需要进一步进行探讨。【
