1、植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测 植物基因组DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测 脱氧核糖核酸 DNA 核糖核酸 RNA 与蛋白质结合在一起以核蛋白 DNP 的形式存在 在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA 前者存在于细胞核内 后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内 例如线粒体DNA mtDNA 和叶绿体DNA ctDNA 背景知识 核酸的存在形式 DNA为白色类似石棉样的纤维状物 RNA的纯品呈白色粉末或结晶 DNA RNA和核苷酸都是极性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 它们的钠盐比游离酸易溶于水 在酸性
2、溶液中 核酸易水解 中性或弱碱性溶液中较稳定 核酸的理化性质 细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸 基本过程 机械方法 超声波处理法 研磨法 匀浆法 化学试剂法 用SDS处理细胞 酶解法 加入溶菌酶 破坏细胞壁 细胞破碎 SDS法SDS是有效的阴离子去垢剂 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合 SDS能够破坏这种价键 CTAB法CTAB是一种阳离子去垢剂 它可以溶解膜与脂膜 使细胞中的DNA 蛋白质复合物释放出来 并使蛋白质变性 使DNA与蛋白质分离 DNA提取 蛋白质常用苯酚 氯仿 异戊醇 25 24 1 或氯仿 异戊醇 24 1 抽提 RNA常选用RNase消化 或是用LiCl来消除大
3、分子的RNA 酚类物质提取液中加少量巯基乙醇 选取幼嫩的材料 多糖提取液中加1 PVP DNA纯化 去杂质 实验材料新鲜蔬菜叶片 去叶脉 试剂2 CTAB抽提液TE缓冲液 pH 8 0 氯仿 异戊醇 24 1 材料与试剂 离心机 水浴锅 研钵 微量移液器 仪器用具 移液器 量程的选择 1 取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中 加1 3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液 迅速研磨 2 将1mL研磨液转入1 5mL离心管中 置于65 水浴中保温20min 其间颠倒混匀2 3次 破碎细胞3 12000r min离心5min 取上清液700 L转到另一离心管中 加入等体积氯仿 异戊醇 24 1 混合液
4、 充分颠倒混匀 12000r min 离心5min 抽提去蛋白4 将上清液移入新的1 5mL离心管内 加600 L异丙醇 颠倒混匀 可见DNA絮状沉淀 沉淀核酸5 12000r min 离心1min 倒掉上清液 将离心管倒置干燥 将沉淀回溶于20 LTE缓冲液待测 操作步骤 1 选取新鲜材料 研磨迅速彻底 研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀 2 若提取产物有颜色 可能是材料中含有较多的多酚类物质 添加巯基乙醇 2 5 尽可能选取幼嫩的材料 3 为了获得具有生物活性的天然核酸 在分离制备过程中必须采用温和的条件 避免过酸过碱 剧烈地搅拌 防止热变性 同时还要避免核酸降解酶类的降解 注意事项
5、DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷 在电场中向正极移动 在一定电场强度下 DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比 电泳原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物 浓度越高 孔隙越小 其分辨能力就越强 仪器和试剂 仪器电泳仪电泳槽灌胶模具等 Tris 硼酸 TBE Tris 乙酸 TAE Tris 磷酸 TPE 常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色 一般与蔗糖 甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液 作用 增加样品比重 以确保DNA均匀沉入加样孔内 形成肉眼可见的指示带 预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色 使加样操作更方便 上样缓冲液 溴化乙锭 EB 是一种荧光染料 EB分子可
6、嵌入核酸双链的碱基对之间 在紫外线激发下 发出红色荧光 其荧光强度与DNA的含量成正比 据此可粗略估计样品DNA浓度 琼脂糖凝胶EB染色 肉眼可见核酸电泳带 其DNA量一般 5ng 核酸染色剂 注意事项 EB是致癌物质 切勿用手接触 更不要污染环境 DNA分子量标准 不同种类DNAMarker 1 凝胶制备制备0 8 琼脂糖凝胶 称取适量琼脂糖加入20mL0 5 TBE 加热至琼脂糖全部熔化 冷却至50 60 时 加入EB至终浓度0 5 g mL 缓慢倒入胶板 待胶凝固后拔出梳子 2 加样取10 lDNA样液与2 l上样buffer混匀 用微量移液器小心加入样品槽 3 电泳接通电源 切记靠近加样孔的一端为负 电压为1 5V cm 长度以两个电极之间的距离计算 待溴酚兰移动到一定位置 停止电泳 4 观察拍照 四 操作步骤 1 结合原理 简述CTAB法分离提取植物总DNA的基本过程 2 为了获得高质量的植物总DNA 在分离提取过程中应注意那些问题 What How 思考
