1、实验二十五 真核基因组DNA分离纯化 外周血白细胞提取DNA（NaI法）,实验二十五 NaI法提取外周血白细胞 DNA 学时数：3 教学目的:掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。 教学重点:实验原理与过程 教学难点:实验原理与方法 使用教具:多媒体 教学方法:互动式、讨论式教学法 讲授内容纲要、要求及时间分配导入：（用一部著名电影导入正题，激发学生探索生命奥秘的兴趣） 12 min交代正题： NaI法提取外周血白细胞DNA 1 min （一）实验目的（简明扼要） 1 min （二）实验原理（提出问题，学生阅读，在问题中理解实验原理） 1214 min （三）实验材料 3 min （
2、四）实验步骤（思路清晰，结合原理讲解） 1516 min （五）注意事项 2 min （六）实验报告 1 min,引言：1min 美国好莱坞电影侏罗纪公园总票房超过3亿美元同时也创造了一种大胆的科学设想：一只蚊子吸取了恐龙的血液，蚊子恰巧又被琥珀完美保存至今日，科学家因此获取了恐龙的DNA，再现了恐龙时代。,真核基因组DNA的分离纯化,回忆理论知识 1.真核生物的核酸类型和分布 2.真核生物DNA的结构,核酸的分离纯化,（一）原则：保证核酸一级结构的完整；排除蛋白质、脂类、多糖等其他分子的污染；无其他核酸分子的污染。,（二）步骤：破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除
3、其他不需要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。,NaI法提取外周血白细胞DNA,实验目的：掌握NaI法提取外周血白细胞DNA的原理和方法。,用NaI法提取白细胞中的DNA可用于Southern杂交、PCR等。例如做亲子鉴定可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。,1.NaI起什么作用？ 2.如何将DNA从蛋白质中释放出来？,思考：,实验原理：从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全，DNA存在于
4、上层水相中，以异丙醇沉淀DNA，离心弃去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。,实验材料,1.器材 （1）高速冷冻离心机。 （2）自动移液器。 （3）枪头、1.5ml离心管（高压灭菌） 2.试剂 （1）6mol/LNaI(2)氯仿/异戊醇（24:1V/V）(3)纯异丙醇（AR） （4）37%异丙醇 （5）双蒸水（高压灭菌） （6）TE缓冲液（PH8.0）高压灭菌,1.取消毒EP管，做好标记，取外周抗凝血（全血）100ul于EP管中，以10000rpm离心1min 。 2.弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。（破红细胞、白细胞膜） 3.混匀后加6M NaI溶液200ul，缓慢摇匀
5、20s。（破核膜,使DNA从核蛋白中解离） 4.加入氯仿/异戊醇（241）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。,实验步骤,（思考：每个步骤的作用？）,7.弃37异丙醇，敞开EP管盖,倒扣在滤纸上将37异丙醇吸干,或放在超净台上吹干，加1xTE溶液30ul，溶解DNA12h以上，制成的DNA液以琼脂糖凝胶电泳鉴定或-20冰箱保存。,5.取上层液360ul，加入另一新EP管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系14000rpm离心12min，使沉淀紧贴EP管壁。 6.弃异丙醇，加37异丙醇1ml（不振动），以14000rpm离心12min。,2.混匀试剂、吸取上清等操作时避免动作剧烈。 3.弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免DNA丢失。 4.DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要70%的乙醇漂洗DNA沉淀物。,注意事项： 1.标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂等应高压灭菌，操作尽量在4以下进行。,实验题目 实验目的 实验原理 实验仪器 实验步骤 实验过程及实验数据记录 实验数据处理与分析，并得出结论,实验报告 时间： 年 月 日,思考题： 1.分离纯化核酸的原则是什么？ 2.NaI法提取外周血白细胞DNA时应注意哪些问题？,愿我们一起在学习中快乐成长,
