1、一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用WO 2013060073 A1摘要提供了一种灭活 gntK功能的产庆大霉素 C1a的工程菌及其应用， 其中，工程菌为绛红色小单抱 菌GK1101 ,已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保 藏，保藏编号为 CGMCC No.5245 。该工程菌能够用于制备抗菌药物。权利要求1.1. 一株产庆大霉素 Cla工程菌， 其特征在于， 所述工程菌为灭活 功能的绛红色 小单抱 H Micwmonospom purpurea) GK1101 , 已于 2011 年 9 月 13 日在中国 微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心登记保
2、藏，保藏编号为 CGMCC No.5245 o2.2.一种如权利要求1所述的工程菌的发酵方法，其特征在于，菌株GK1101发酵前先用稀释平板法分离出产胞丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37 C培养10天，挖块接种于种子 培养基，37C摇床培养 28 h,转速为280rpm ,然 后按10%接种量转接于发酵培养基，37 C摇 床培养124 h,转速为280rpm;所述种子培养基： 葡萄糖0.1-1.0% ,玉米淀粉1.0-2.0% ,玉 米粉0.5-2.5% ,蛋 白豚 0.1-0.8% , 黄豆饼粉 0.5-1.5% , KN0 3 0.05-0.10% , CaC0 3 0.1-0.5%
3、, p H B -755,发酵培养基：玉米淀粉3.0-6.0% ,玉米粉1.0-2.0% ,蛋白豚0.1-0.8% , 黄豆饼粉 1.0-4.0 % , KN0 3 0.01-0.10% , (NH 4)2S0 40.1-0.5% , CaC0 3 0.1-0.5%, 淀粉酶 0.001-0.025% , pH 6 -75 5。3.3.如权利要求 1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用4.说明一株产庆大霉素 Cla的工程菌及其应用技术领域本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌的构建及其应用，具体地说， 本发明涉及 一株产庆大霉素 Cla工程菌，应用于抗生素制造。背景技术小单胞菌可产生丰富的次级
4、代谢产物，特别是氨基糖甘类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。 这些小单胞菌分布奇特， 生长缓慢且细胞壁结构特殊， 故研究进展缓慢。 止匕外， 由于缺乏通用的基因操作系统，小单胞菌遗传操作困难， 使得对其分子生物学的研究 也大大落后于链霉菌。小单抱菌是庆大霉素产生菌，庆大霉素是氨基糖甘类抗生素，已在临床上应用了近半个世纪，是我国、 乃至全世界抗感染必备的基本药物。庆大霉素属多组分代谢产物，起抗菌作 用的主要组分为 C族复合物：Cl、C2和Cla。庆大霉素产生菌代谢产物可开发的组分十分丰富，如庆大霉素 Cla是合成抗耐药菌药物依替米星（Etimicin）的前体； 庆大霉素 B是进一 步合成
5、抗耐药菌药物异帕米星的母体；庆大霉素、B、 X是进一步开发抗原虫的良好药物；最新研究发现氨基糖甘类抗生素还具有抗HIV等功效。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，具有极大意义。尽管人们对小单抱菌和庆大霉素的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直 未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高了近万倍， 而庆大霉素仅提高了几十倍，差别非常悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进展，但在小单抱菌中的应用进展缓慢。依替米星是新型半合成庆大霉素，是中国独创的抗生素
6、一类新药，已在多国申请专利，其知识产权得到了有效保护，需求量大，是本类抗生素临床首选药物。但由于合成依替米星的母体是庆大霉素Cla （图1 ）。而庆大霉素 Cla需要从庆大霉素产生菌的代谢产物中分离才能得到。不幸的是，到目前为止，所有庆大霉素产生菌的代谢产物是复合物，主要包括庆大霉素 Cl、C2和Cla等。这些复合物化学结构相近，理化性质相似，从中分离单组份庆大霉素Cla非常困难，导致庆大霉素 Cla供不应求，且生产成本居高不下，层析分离周期长，收率低， 料耗大，污染严重， 提取精制工艺复杂，而且产品质量不稳定，与庆大霉素Cla结构相似的副产物随时出现干扰，给依替米星产品质量控制造成了极大的不
7、确定性，严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性，是迫切需要解决的科学难题。若能获得专一性庆大霉素 Cla产生菌， 则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的经济效 益，社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全用药，提供了可靠保障。发明内容本发明的目的在于提供一株产庆大霉素Cla的工程菌该工程菌为灭活功能的绛红色小单抱菌（M rami i? /wra purpurea） GK1101 菌株， 已于 2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5245 。所述的工程菌的发酵方法，具体如下：菌株GK1101发酵前先用稀释平板法
8、分离出产抱丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37 C培养10天，挖块接种于种子培养基，37 C摇床培养28 h,转速为280rpm ,然后按10%接种量转接于发酵培养基，37 C摇床培养124 h,转速为280rpm;所述种子培养基：葡萄糖0.1-1.0% ,玉米淀粉1.0-2.0% ,玉米粉0.5-2.5% , 蛋 白豚 0.1-0.8% , 黄豆饼粉 0.5-1.5% , KN0 3 0.05-0.10% , CaC0 3 0.1-0.5% , pH6.5-7.5 , 发酵培养基：玉米淀粉 3.0-6.0% , 玉米粉1.0-2.0% , 蛋白豚0.1-0.8% , 黄 豆饼粉 1.0-
9、4.0 % , KN0 3 0.01-0.10% , （NH 4）2S040.1-0.5% , CaC0 3 0.1-0.5% , 淀粉酶 0.001-0.025% , pH 6 -75 5。所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用 菌株GK1101的筛选， 主要包括以下几个步骤:A. gA/基因置换质粒的构建；B.置换质粒转化绛红色小单抱菌；C.转化子的筛选；D.工程菌组分的鉴定。基因置换的方法为 PCR扩增上下游各2000 bp左右的片段作为同源交换臂，并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间，将此三个片段同时连接到穿梭载体如PKC1139上，另外载体pKC1139上的安普霉素抗性基因也可
10、用于之后的筛选环节。其中转化是以 E ET12657（pUZ8002） 介导的结合转移方法。过程为先筛选同时含安普 霉素抗性（Am R）和红霉素抗性（ermER）的菌株，松弛培养后再从中筛选含红霉素抗性（ermE R）但对安普霉素敏感 （Ams ）的菌株。 发酵液组分检测采用薄层层析（TLC）,组分精确测定采 用HPLC-MS 法。本发明获得了一株产生庆大霉素Cla的工程菌，该工程菌为绛红色小单抱菌（Micromonospora purpurea） GK1101 菌株， 已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心登记保藏，其简称 CGMCC,地址为北京市朝阳区北辰西
11、路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 5245 。本发明的工程菌用于产庆大霉素Cla,大大简化了生产工艺，并降低生产成本，减少环境污染，同时提高了产品质量。达到了可大规模生产庆大霉素 Cla的目标。附图说明图1为庆大霉素化学结构式 图2为重组质粒 pFD306图谱。图3为基因功能同源交换灭活(敲除)示意图I:亲株染色体基因位置；II:与染色体 KB 1侧单交换； W:与染色体 KB2侧单交换；IV染色体回复突变；V:与:染色体双交换。图4为亲株绛红色小单抱菌S-1212与工程菌绛红色小单抱菌GK1101代谢产物的 TLC比较分析结果；其中A为工程菌绛红色小单抱菌GK1101代谢产物；B
12、为亲株绛红色小单抱菌S- 1212代谢产物。3,HPLC-MS 图谱。对应的是庆大霉素5为亲株绛红色小单抱菌S-1212代谢产物的应的是庆大霉素Cla ,分子量450.2;峰2,对 应的是庆大霉素C2b ,分子量464.3 ;峰其中总离子流图谱的峰1C2, 分子量464.3 ;峰 4,对应的是庆大霉素 C2a ,分子量464.3 ;峰5, 对应的是庆大霉素Cl, 分子量478.3图6为工程菌绛红色小单抱菌GK1101代谢产物的 HPLC-MS图谱。其中总离子流图谱的峰15对应的是庆大霉素Cla,分子量450.2;峰20,对应的是庆大霉素C2b ,分子量464.3 ;未检测到庆大霉素Cl、 C2
13、和C2a组分的痕迹。具体实施方式 实施例1 :本发明包括以下主要步骤:1 .构建基因置换质粒根据庆大霉素生物合成基因簇(可参考 GenBank Accession Number AY524043), 分别在gntK基因(SEQ.NO.l )上下游设计两对引物LB1和LB2以及LB3和LB4,以出发菌株S-1212 (周 晓兰， 黄建忠，施碧红， 施巧琴.影响绛红色小单抱菌(M rami O?wra purpurea)S-1212抱子 萌发的几个主要因子的研究 .福建师范大学学报(自然科学版)，Vol.18 No. IP 7275 )的染 色体DNA ( CTAB 法)为模板，分别进行 PCR
14、,扩增得到 gntK两端的 DNA序列， 作为同源 交换臂；上游交换臂称为 KB1 ( LB1/LB2),长度为2076 bp；下游交换臂称为 KB2(LB3/LB4),长度为2044bp。以质粒pAGe为模板(朱碧银，洪文荣，严绍德，朱宝 泉，林玉双，封成军.黑暗链霉菌 DNA同源重组系统的构建.生物技术通报 2011 ( 4),162166. ) , E1和E2为引物， 扩增抗性筛选标记基因ermE,长度为1711bp( Fig.2) 。KBl、KB2和ermE分别经 pMD19-T(TA) 克隆，得到阳性质粒，依次命名为 pFD301、 pFD302和pFD303。pFD303经 Spe
15、 I/Xba I酶切，回收1711 bp片段，与经 Xba I酶切过的 pFD301 (4758 bp )进行酶连， 转化和筛选，得到阳 性质粒，命名为pFD304;用Xba I酶切pFD302 ,回收2048bp片段，与经 Xba I酶切过的pFD304 ( 6463 bp ) 进行酶连，筛选得到阳性质粒，命名为 pFD305 ;用Bgl II酶切 pFD305 , 回收 5801 bp片段， 与经 BamH I酶切过的 pKC1139 ( 6500 bp ) 进行酶连， 经筛选， 最终得到阳性质粒，命名为pFD306 (图2)表1实施例所涉及的引物SequenceaLB1AAGCn AGA
16、TTCT ATC TCCCGCATACCGTCC登话dHL3空全LB2TCTAG ATGIG GCCG AAGTACGTC CTTGAGLB3TCTAGAATCGTGGTCAG CTCCGCGTLB4GAATTCjAG 工TUTGEAGGCeGACTTCGnCETCTTCCG袁岸cRI,先建ElACTAGICAGAAGGTCG.ACTCGCACCG5泡E2TCTAGAGTACCAGCCCGACCCGAGmIPlTGCTGTGCTCGACCAGACGTP2GAGATTTTCGACTCCCTCGCCP3ACCGTATCGAACATCAGGGCP4ATCAGAGGTTGATGTCGGCCP5ATCA
17、ACCGCGACTAGCATCP6CAGCTAACGA.AAGGGACCARestriction enzyme site are indicated by single underlines and box2.置换质粒 pFD306转化绛红色小单抱菌S-1212将置换质粒 pFD306 转入 E.coli ET12567 (pUZ8002) 中， 得到供体菌 E.coli ET12567 (pUZ8002, pFD306)。然后通过接合转移的方法转化绛红色小单抱菌S-1212抱子，33 C培养20 h后用含有红霉素和蔡咤酸(终浓度均为 25 g / mL)的水溶液覆盖，37 C继续培养5天长出
18、转化子，将所获得的ermER转化子点接至含有红霉素(25-50 g / mL)、安普霉素(25-501 g I mL)和蔡咤酸(25 11 g / mL)的平板培养基上放置37 C进行培养。由于置换质粒pFD306含温敏型复制启动子，当培养温度超过 34 C时，该游离质粒在链霉菌中不能自我复制，只有质粒pFD306同源交换整合到绛红色小单抱菌染色体上的接合子才能生长，表现出对红霉素和安普霉素抗性，8d后胞子生长良好，初步判断为单交换菌株，将长好的抱子转接到斜面培养基上。进一步提取染色体DNA进行PCR验证并对 PCR产物进行测序都证实了单交换插入。得到一株单交换菌株 GK1008 (pFD30
19、6)。3.双交换菌株筛选与发酵代谢产物变化的定性检测将单交换菌株 GK1008（pFD306）在不含抗生素的斜面上连续传3代后，进行分离纯化，挑取单菌落分别点种到含红霉素抗性（红霉素50 r g/mL）的平板和含安普霉素抗性（安普霉素50 rg/mL）的平板上，从中筛选对安普霉素敏感而具有红霉素抗性的菌株。挑选其中一株，提取 其染色体DNA作为模板，设计3对引物（P1/P2, P3/P4 和P5/P6;见表1和图3 ）进行PCR 验证， 并测序，确定为双交换菌株后，命名为绛红色小单抱菌 GK1101 o对该菌株进行发酵（见实施例2步骤1）,过滤收集发酵液。滤液通过硅胶GF254薄层层析检测，结
20、果发现其主 要成分为 Cla ,含少量 C2b （图4 A）,未见 Cl、C2和C2a组分（图4 B ）;滤液通过 HPLC-MS 定性检测 （图6）,与亲株绛红色小单抱菌S-1212的代谢产物（图5 ）比较，结果是主要成分 为 Cla （峰1）,少量 C2b （峰3）,未见 C1 （峰5）、C2 （峰2）和 C2a （epi-C2 峰4）组分的痕迹。组分的HPLC-MS分析（图5和图6）:电喷雾离子阱质谱， C18拄；流动相：0.2M三氟乙 酸水溶液： 甲醇 （95:5 ）;流速0.6 ul/min 柱温：30,进样量luL。实施例2:绛红色小单抱菌GK1101代谢产物 Cla的制备本发明提
21、供的 灭活工程菌绛红色小单抱菌GK1101可直接用于制造庆大霉素Cla。庆大霉素Cla的制备如下（洪文荣.庆大霉素发酵工艺最佳化.中国医药工业杂志.1994 , 25（l）.pl-3,）:1.绛红色小单抱菌 GK1101菌株的发酵培养种子培养基： 葡萄糖0.1%,玉米淀粉1.0%,玉米粉1.5%,蛋白豚0.2%,黄豆饼粉1.0% KNO3 0.05 , CaC03 0.5%, p H 7 6 0发酵培养基：玉米淀粉6.0% ,玉米粉1.0% ,蛋白豚 0.4% ,黄豆饼粉 2.0 % , KNQ 0.01 ,（NH4）2SO 40.1 , CaCO 3 0.5 ,淀粉酶 0.025% , pH
22、7b5摇瓶发酵：将实例1中步骤3获得的绛红色小单抱菌GK1101进行发酵。发酵前先用稀 释平板法分离出产胞丰富的单菌落再转接于斜面培养基，37 C培养10天，挖块接种于种子培养基（装量为 50mL I 250mL 三角瓶），37 C摇床培养 28 h（转速为280rpm）。然后按10% 接种量转接于发酵培养基（装量为50mL/250mL 三角瓶），37 C摇床培养124 h（转速为280rpm）。扩大发酵：20000升发酵罐生产，搅拌转速180转/分钟，通气量1 : 0.5-1.0 （M 3 /M 3 -min）,培 养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等同于摇瓶发酵。2代谢产物提取精制A、粗
23、提扩大发酵后的发酵液加10%自来水稀释后，加入盐酸，酸化到pH2.0-3.0 ,充分搅拌4小时；然后用氢氧化钠溶液回调至pH5.0-6.5 ,投入732NH 4 +树脂静态吸附 6-8小时。 树脂投放量按5万u/mL左右计算。收集吸附饱和树脂，用自来水漂洗干净（无漂浮菌丝体为止）。 饱 和树脂装柱，用两倍饱和树脂体积的0.5M HC1溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，然后改用0.01%氨水进行碱洗，当流出液达 pH 9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上， 改用4%的氨水进行洗脱，氨水用量为饱和树脂体积的8-10倍，洗脱时间控制在8-10小时，收集洗脱液。B、精制与结晶洗脱液经薄膜
24、浓缩到约 25-30万u /mL（ Cla含量达90%以上），用浓硫酸调至 pH5.5-6.0.活 性炭脱色到透光度达 92%以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入 95%以上乙醇，进行结 晶，时间3 4小时， 之后经固液分离， 85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。湿成品经真空干燥（真空度500mmHg以上，温度600C,干燥6小时），即得硫酸庆大霉素 Cla成品，收 率80%以上。专利引用一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用WO 2013060073 A1摘要提供了一种灭活 gntK功能的产庆大霉素 C1a的工程菌及其应用，其中，工程菌为绛红色小单抱菌GK1101 ,已于2011年9月13日在中国微
25、生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保 藏，保藏编号为 CGMCC No.5245 。该工程菌能够用于制备抗菌药物。权利要求1.1. 一株产庆大霉素 Cla工程菌， 其特征在于， 所述工程菌为灭活 功能的绛红色 小单抱 H Micwmonospom purpurea） GK1101 , 已于 2011 年 9 月 13 日在中国 微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为 CGMCC No.5245 o2.2.一种如权利要求 1所述的工程菌的发酵方法，其特征在于， 菌株GK1101发酵前先用稀释平板法分离出产胞丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37 C培养10天，挖块接
26、种于种子 培养基，37C摇床培养 28 h,转速为280rpm ,然 后按10%接种量转接于发酵培养基，37 C摇 床培养124 h,转速为280rpm;所述种子培养基： 葡萄糖0.1-1.0% ,玉米淀粉1.0-2.0% ,玉 米粉0.5-2.5% ,蛋白豚 0.1-0.8% , 黄豆饼粉 0.5-1.5% , KN0 3 0.05-0.10% , CaC0 3 0.1-0.5%, p H B -石5,发酵培养基：玉米淀粉3.0-6.0% ,玉米粉1.0-2.0% ,蛋白豚0.1-0.8% , 黄豆饼粉 1.0-4.0 % , KN0 3 0.01-0.10% , (NH 4)2S0 40.
27、1-0.5% , CaC0 3 0.1-0.5%, 淀粉酶 0.001-0.025% , pH 6 -75 5。3.3.如权利要求 1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用4.说明一株产庆大霉素 Cla的工程菌及其应用技术领域本发明属于抗生素制药领域，涉及一种工程菌的构建及其应用，具体地说， 本发明涉及 一株产庆大霉素 Cla工程菌，应用于抗生素制造。背景技术小单胞菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖甘类抗生素， 如庆大霉素、西索米星和福提米星等。 这些小单胞菌分布奇特， 生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。 止匕外，由于缺乏通用的基因操作系统，小单胞菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的
28、研究 也大大落后于链霉菌。小单抱菌是庆大霉素产生菌，庆大霉素是氨基糖甘类抗生素，已在临床上应用了近半个世纪，是我国、 乃至全世界抗感染必备的基本药物。庆大霉素属多组分代谢产物，起抗菌作 用的主要组分为 C族复合物：Cl、C2和Cla。庆大霉素产生菌代谢产物可开发的组分十分丰富，如庆大霉素 Cla是合成抗耐药菌药物依替米星（Etimicin）的前体； 庆大霉素 B是进一 步合成抗耐药菌药物异帕米星的母体；庆大霉素、B、 X是进一步开发抗原虫的良好药物；最新研究发现氨基糖甘类抗生素还具有抗HIV等功效。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究，具有极大意义。尽管人们对小单抱
29、菌和庆大霉素的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直 未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高了近万倍， 而庆大霉素仅提高了几十倍，差别非常悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进展，但在小单抱菌中的应用进展缓慢。依替米星是新型半合成庆大霉素，是中国独创的抗生素一类新药，已在多国申请专利，其知识产权得到了有效保护，需求量大，是本类抗生素临床首选药物。但由于合成依替米星的母体是庆大霉素Cla (图1 )。而庆大霉素 Cla需要从庆大霉素产 生菌的代谢产物中分离才能得到。不幸的是，到
30、目前为止，所有庆大霉素产生菌的代谢产物是复合物，主要包括庆大霉素 Cl、C2和Cla等。这些复合物化学结构相近，理化性质相似，从中分离单组份庆大霉素Cla非常困难，导致庆大霉素 Cla供不应求，且生产成本居高不下，层析分离周期长，收率低， 料耗大，污染严重， 提取精制工艺复杂，而且产品质量不稳定，与庆大霉素Cla结构相似的副产物随时出现干扰，给依替米星产品质量控制造成了极大的不确定性，严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性，是迫切需要解决的科学难题。若能获得专一性庆大霉素 Cla产生菌，则以上所有问题将迎刃而解，其所带来的经济效 益，社会效益和环境效益等是极其巨大的，更重要的是给清洁生产，安全
31、用药，提供了可靠保障。发明内容本发明的目的在于提供一株产庆大霉素Cla的工程菌该工程菌为灭活功能的绛红色小单抱菌(M rami i? /wra purpurea) GK1101 菌株， 已于 2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5245 。所述的工程菌的发酵方法，具体如下：菌株GK1101发酵前先用稀释平板法分离出产抱丰富的单菌落后，再转接于斜面培养基，37 C培养10天，挖块接种于种子培养基，37 C摇床培养28 h,转速为280rpm ,然后按10%接种量转接于发酵培养基，37 C摇床培养124 h,转速为280rpm;所
32、述种子培养基：葡萄糖0.1-1.0% ,玉米淀粉1.0-2.0% ,玉米粉-0.5-2.5% , 蛋 白豚 0.1-0.8% , 黄豆饼粉 0.5-1.5% , KN0 3 0.05-0.10% , CaC0 3 0.1-0.5% , pH6.5-7.5 , 发酵培养基：玉米淀粉 3.0-6.0% , 玉米粉1.0-2.0% , 蛋白豚0.1-0.8% , 黄 豆饼粉 1.0-4.0 % , KN0 3 0.01-0.10% , (NH 4)2S040.1-0.5% , CaC0 3 0.1-0.5% , 淀粉酶 0.001-0.025% , pH 6 -75 5。所述的工程菌在制备抗菌药物中
33、的应用 菌株GK1101的筛选， 主要包括以下几个步骤:A. gA/基因置换质粒的构建；B.置换质粒转化绛红色小单抱菌;C.转化子的筛选；D.工程菌组分的鉴定基因置换的方法为 PCR扩增上下游各2000 bp左右的片段作为同源交换臂，并将红霉素抗性基因作为筛选标记插入两交换臂之间，将此三个片段同时连接到穿梭载体如PKC1139上,另外载体pKC1139上的安普霉素抗性基因也可用于之后的筛选环节。其中转化是以 E ET12657（pUZ8002） 介导的结合转移方法。过程为先筛选同时含安普 霉素抗性（Am R）和红霉素抗性（ermER）的菌株，松弛培养后再从中筛选含红霉素抗性（ ermE R）但
34、对 安普霉素敏感 （Ams ）的菌株。 发酵液组分检测采用薄层层析（TLC）,组分精确测定采 用HPLC-MS 法。本发明获得了一株产生庆大霉素Cla的工程菌，该工程菌为绛红色小单抱菌（Micromonospora purpurea） GK1101 菌株， 已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏 管理 委员会普通微生物中心登记保藏，其简称 CGMCC,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为 CGMCC No. 5245 。本发明的工程菌用于产庆大霉素Cla,大大简化了生产工艺，并降低生产成本，减少环境污染，同时提高了产品质量。达到了可大规模生产庆大霉素 Cla的目标。附图说明图
35、1为庆大霉素化学结构式。图2为重组质粒 pFD306图谱。图3为基因功能同源交换灭活（敲除）示意图。I:亲株染色体基因位置；II:与染色体 KB 1侧单交换；W:与染色体 KB2侧单交换；IV染色体回复突变；V:与:染色体双交换。图4为亲株绛红色小单抱菌S-1212与工程菌绛红色小单抱菌GK1101代谢产物的 TLC比较分析结果；其中A为工程菌绛红色小单抱菌GK1101代谢产物；B为亲株绛红色小单抱菌S- 1212代谢产物。图5为亲株绛红色小单抱菌S-1212代谢产物的 HPLC-MS图谱。其中总离子流图谱的峰1对 应的是庆大霉素Cla ,分子量450.2;峰2,对应的是庆大霉素C2,分子量4
36、64.3 ;峰3,对 应的是庆大霉素 C2b,分子量 464.3 ;峰4,对应的是庆大霉素C2a ,分子量464.3 ;峰5, 对应的是庆大霉素 Cl, 分子量478.3。图6为工程菌绛红色小单抱菌GK1101代谢产物的 HPLC-MS图谱。其中总离子流图谱的峰15对应的是庆大霉素Cla,分子量450.2;峰20,对应的是庆大霉素C2b ,分子量464.3 ;未检测到庆大霉素Cl、 C2和C2a组分的痕迹。具体实施方式 实施例1 :本发明包括以下主要步骤:1 .构建基因置换质粒根据庆大霉素生物合成基因簇(可参考 GenBank Accession Number AY524043),分别在gnt
37、K基因(SEQ.NO.l )上下游设计两对引物LB1和LB2以及LB3和LB4,以出发菌株S-1212 (周 晓兰， 黄建忠，施碧红， 施巧琴.影响绛红色小单抱菌(M rami O?wra purpurea)S-1212抱子 萌发的几个主要因子的研究 .福建师范大学学报(自然科学版)，Vol.18 No. IP 7275 )的染 色体DNA ( CTAB 法)为模板，分别进行 PCR ,扩增得到 gntK两端的 DNA序列， 作为同源 交换臂；上游交换臂称为KB1 ( LB1/LB2),长度为2076 bp；下游交换臂称为KB2(LB3/LB4),长度为2044bp。以质粒pAGe为模板(朱碧
38、银，洪文荣，严绍德，朱宝 泉，林玉双，封成军.黑暗链霉菌 DNA同源重组系统的构建.生物技术通报 2011 ( 4),162 166. ) , E1和E2为引物， 扩增抗性筛选标记基因ermE,长度为1711bp( Fig.2) 。KBl、KB2和ermE分别经 pMD19-T(TA) 克隆，得到阳性质粒，依次命名为 pFD301、 pFD302和pFD303。pFD303经 Spe I/Xba I酶切，回收1711 bp片段，与经 Xba I酶切过的 pFD301 (4758 bp )进行酶连， 转化和筛选，得到阳 性质粒，命名为pFD304;用Xba I酶切pFD302 ,回收2048bp
39、片段，与经 Xba I酶切过的pFD304 ( 6463 bp ) 进行酶连，筛选得到阳性质粒， 命名为 pFD305 ;用Bgl II酶切 pFD305 , 回收 5801 bp片段，与经 BamH I酶切过的pKC1139 ( 6500 bp ) 进行酶连，经筛选，最终得到阳性质粒，命名为pFD306 (图2)。表1实施例所涉及的引物N2昼已Sequencear LBiAAGCn AGATCT ATC TCCCGCATACCGTCC登话dHL 3次HLB2TCTAG ATGTG GCCG AAGTACGTC CTTGAGAMLB3TCTAGAATCGTGGTCAG CTCCGCGTLB4G
40、AATTCGATCllGCAG GCCGACTTC GACCTCTTCCGEcoRL,先注ElACTAGTCAGAAGGTCG.ACTCGCACCGS-乳E2TCTAGAGTACCAGCCCGACCCGAGPlTGCTGTGCTCGACCAGACGTP2GAGATTTTCGACTCCCTCGCCpmACCGTATCGAACATCAGGGCP4ATCAGAGGTTGATGTCGGCCP5ATCAACCGCGACTAGCATCP6CAGCTAACGA.AAGGGACCARestriction enzyme site are indicated by single underlines and bo
41、x2.置换质粒 pFD306转化绛红色小单抱菌S-1212将置换质粒 pFD306 转入 E.coli ET12567 （pUZ8002） 中， 得到供体菌 E.coli ET12567 （pUZ8002, pFD306）。然后通过接合转移的方法转化绛红色小单抱菌S-1212抱子，33 C培养20 h后用含有红霉素和蔡咤酸（终浓度均为 25 g / mL）的水溶液覆盖，37 C继续培养5天长出转化子，将所获得的ermER转化子点接至含有红霉素（25-50 g / mL）、安普霉素（25-501 g I mL）和蔡咤酸（25 11 g / mL）的平板培养基上放置37 C进行培养。由于置换质粒p
42、FD306含温敏型复制启动子，当培养温度超过 34 C时，该游离质粒在链霉菌中不能自我复制，只有质粒pFD306同源交换整合到绛红色小单抱菌染色体上的接合子才能生长，表现出对红霉素和安普霉素抗性，8d后胞子生长良好，初步判断为单交换菌株，将长好的抱子转接到斜面培养基上。进一步提取染色体DNA进行PCR验证并对 PCR产物进行测序都证实了单交换插入。得到一株单交换菌株 GK1008 （pFD306）。3.双交换菌株筛选与发酵代谢产物变化的定性检测将单交换菌株 GK1008（pFD306）在不含抗生素的斜面上连续传3代后，进行分离纯化，挑取单菌落分别点种到含红霉素抗性（红霉素50 r g/mL）的
43、平板和含安普霉素抗性（安普霉素50 rg/mL）的平板上，从中筛选对安普霉素敏感而具有红霉素抗性的菌株。挑选其中一株，提取 其染色体DNA作为模板，设计3对引物（P1/P2, P3/P4 和P5/P6;见表1和图3 ）进行PCR 验证， 并测序，确定为双交换菌株后，命名为绛红色小单抱菌GK1101 o对该菌株进行发酵（见实施例2步骤1）,过滤收集发酵液。滤液通过硅胶GF254薄层层析检测，结果发现其主 要成分为 Cla ,含少量 C2b （图4 A）,未见 Cl、C2和C2a组分（图4 B ）;滤液通过| HPLC-MS 定性检测 （图6）,与亲株绛红色小单抱菌S-1212的代谢产物 （图5
44、）比较，结果是主要成分 为 Cla （峰1）,少量 C2b （峰3）,未见 C1 （峰5）、C2 （峰2）和 C2a （epi-C2 峰4）组分的痕迹。组分的HPLC-MS分析（图5和图6）:电喷雾离子阱质谱，C18拄；流动相：0.2M三氟乙酸水溶液：甲醇 （95:5 ）;流速0.6 ul/min 柱温：30,进样量luL。实施例2:绛红色小单抱菌GK1101代谢产物 Cla的制备本发明提供的 灭活工程菌绛红色小单抱菌GK1101可直接用于制造庆大霉素Cla。庆大霉素Cla的制备如下（洪文荣.庆大霉素发酵工艺最佳化.中国医药工业杂志.1994 , 25（l）.pl-3,）:1.绛红色小单抱菌G
45、K1101菌株的发酵培养种子培养基： 葡萄糖0.1%,玉米淀粉1.0%,玉米粉1.5%,蛋白豚0.2%,黄豆饼粉1.0%KNO3 0.05 , CaC03 0.5%, p H 7 6 0发酵培养基：玉米淀粉 6.0% ,玉米粉1.0% ,蛋白豚 0.4% ,黄豆饼粉 2.0 % , KNQ 0.01 , （NH4）2SO 40.1 , CaCO 3 0.5 ,淀粉酶 0.025% , pH7b5摇瓶发酵： 将实例1中步骤3获得的绛红色小单抱菌GK1101进行发酵。发酵前先用稀 释平板法分离出产胞丰富的单菌落再转接于斜面培养基，37 C培养10天， 挖块接种于种子培养基（装量为 50mL I 2
46、50mL 三角瓶），37 C摇床培养 28 h（转速为280rpm）。然后按10% 接种量转接于发酵培养基（装量为50mL/250mL 三角瓶），37 C摇床培养124 h（转速为280rpm）。扩大发酵：20000升发酵罐生产，搅拌转速180转/分钟，通气量1 : 0.5-1.0 （M 3 /M 3 -min）,培 养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等同于摇瓶发酵。2代谢产物提取精制A、粗提扩大发酵后的发酵液加10%自来水稀释后，加入盐酸，酸化到pH2.0-3.0 ,充分搅拌4小时；然后用氢氧化钠溶液回调至pH5.0-6.5 ,投入732NH 4 +树脂静态吸附 6-8小时。 树脂投放量按5万u/mL左右计算。收集吸附饱和树脂，用自来水漂洗干净（无漂浮菌丝体为止）。 饱 和树脂装柱，用两倍饱和树脂体积的
