1、蛋白质的生物合成（翻译）Protein Biosynthesis，Translation,第 十 二 章,王晓华,主 要 内 容,掌握三种RNA在蛋白质生物合成中的作用 掌握核蛋白体循环 熟悉蛋白质的生物合成过程 熟悉翻译后的加工 熟悉抗生素的作用原理,翻 译,以mRNA为直接模板，tRNA为氨基酸运载体，核蛋白体为装配场所，共同协调完成蛋白质生物合成的过程。即将mRNA的碱基排列顺序转译成多肽链中氨基酸的排列顺序。,蛋白质合成体系Protein Biosynthesis System,第 一 节,真核生物的翻译,基本原料：20种编码氨基酸 模板：mRNA 运载体：tRNA 装配机：核蛋白体
2、主要酶和蛋白质因子：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶、起始因子、延长因子、释放因子等 能源物质：ATP、GTP 无机离子：Mg2+、 K+,蛋白质生物合成体系,一、mRNA是蛋白质生物合成的直接模板,mRNA的基本结构,从mRNA 5-端起始密码子AUG到3-端终止密码子之间的核苷酸序列，称为开放阅读框架(open reading frame, ORF)。,遗传学将编码一个多肽的遗传单位称为顺反子(cistron)。 原核细胞中数个结构基因常串联为一个转录单位，转录生成的mRNA可编码几种功能相关的蛋白质，为多顺反子(polycistron) 。 真核mRNA只编码一种蛋白质，为单顺反子(sin
3、gle cistron) 。,原核生物的多顺反子,真核生物的单顺反子,目 录,mRNA上存在遗传密码,密码子：mRNA分子上从5至3方向，由AUG开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上某一个氨基酸或蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码子(triplet coden)。,起始密码(initiation coden): AUG,终止密码(termination coden): UAA，UAG，UGA,3个相邻的碱基1个aa，43种排列64种 密码子,三联密码有三种阅读方式,以起始密码AUG开始，形成一个开放读码框架（open reading frame, ORF）,遗传密码的特点,1. 方向性
4、(directional),翻译时遗传密码的阅读方向是53，即读码从mRNA的起始密码子AUG开始，按53的方向逐一阅读，直至终止密码子。,2. 连续性(commaless),编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读，密码间既无间断也无交叉。,基因损伤引起mRNA阅读框架内的碱基发生插入或缺失，可能导致框移突变(frameshift mutation)。,3. 简并性(degenerate),一种氨基酸可具有2个或2个以上的密码子为其编码。这一特性称为遗传密码的简并性。 除色氨酸和甲硫氨酸仅有1个密码子外，其余氨基酸有2、3、4个或多至6个三联体为其编码。为同一种氨基酸编码的各密码子称为简
5、并性密码子，也称同义密码子 。, 三联密码上的第一、二位碱基大多相同，只是第三位不同。 兼职：AUG，甲硫氨酸+起始密码子。,各种氨基酸的密码子数目,4. 通用性(universal),蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。,密码子与反密码子配对时出现不遵从碱基配对规律的情况。主要表现为密码子第三位碱基与反密码子第一碱基不严格互补，但不影响翻译正确。,5. 摆动性(wobble),反密码子,密码子,摇摆性： 反密码子中的 G即可形成 GC 配对 又可形成 G=U 配对,密码子、反
6、密码子配对的摆动现象,二、rRNA,rRNA与蛋白质结合构成核蛋白体（核糖体），分为大小亚基，是蛋白质生物合成的场所,核蛋白体的组成,原核生物翻译过程中核蛋白体结构模式:,A位：氨基酰位 (aminoacyl site),P位：肽酰位 (peptidyl site),E位：排出位 (exit site),目 录,5,氨基酸臂的GU及7对碱基螺旋可被氨酰tRNA合成酶识别,TC环可与核糖体结合,活化的CCA末端可连接aa,反密码环含反密码子,三、tRNA是氨基酸的运载工具,tRNA的种类,四、蛋白质生物合成需要酶类、蛋白质因子等,（一）重要的酶类,氨基酰-tRNA合成酶(aminoacyltRN
7、A synthetase)，催化氨基酸的活化； 转肽酶(peptidase)，催化核蛋白体P位上的肽酰基转移至A位氨基酰-tRNA的氨基上，使酰基与氨基结合形成肽键;并受释放因子的作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，使P位上的肽链与tRNA分离； 转位酶(translocase)，催化核蛋白体向mRNA3-端移动一个密码子的距离，使下一个密码子定位于A位。,（二）蛋白质因子,起始因子（initiation factor，IF） 延长因子（elongation factor，EF） 释放因子（release factor，RF）,参与原核生物翻译的各种蛋白质因子及其生物学功能,参与真核生物翻译
8、的各种蛋白质因子及其生物学功能,蛋白质生物合成的能源物质为ATP和GTP; 参与蛋白质生物合成的无机离子有Mg2+、K+ 等。,（三）能源物质及离子,第二节氨基酸的活化,Activation of Amino Acids,氨基酸与特异的tRNA结合形成氨基酰-tRNA的过程称为氨基酸的活化。,参与氨基酸的活化的酶： 氨基酰-tRNA合成酶,一、 氨基酸活化形成氨基酰-tRNA,第一步反应,氨基酸 ATP-E 氨基酰-AMP-E PPi,目 录,第二步反应,氨基酰-AMP-E tRNA 氨基酰-tRNA AMP E,目 录,氨基酰-tRNA合成酶,结构,氨基酰tRNA合成酶的3个结合位点,氨基酸
9、和ATP形成氨基酰腺苷,氨基酰转移到tRNA上,tRNA负载了氨基酸,氨基酰-tRNA合成酶对两种底物氨基酸和tRNA都有高度特异性识别作用。 氨基酰-tRNA合成酶具有校正活性:，有水解酯键的催化作用，发挥酶的校正活性。 氨基酰-tRNA的表示方法： Ala-tRNAAla Ser-tRNASer Met-tRNAMet,真核生物： Met-tRNAiMet 原核生物： fMet-tRNAifMet,（二）起始肽链合成的氨基酰-tRNA,真核生物以甲硫氨酸为起始（met）， 原核生物以甲酰甲硫氨酸为起始（fmet),蛋白质生物合成过程 The Process of Protein Biosy
10、nthesis,第 三 节,翻译的起始(initiation) 翻译的延长(elongation) 翻译的终止(termination ),整个翻译过程可分为 ：,翻译过程从阅读框架的5-AUG开始，按mRNA模板三联体密码的顺序延长肽链，直至终止密码出现。 mRNA5 3 5AUG 3UAA ,UAG,UGA 肽链延长方向 N C,进位 成肽 转位,一、肽链合成起始,指mRNA和起始氨基酰-tRNA分别与核蛋白体结合而形成翻译起始复合物 (translational initiation complex)。,原核、真核生物各种起始因子的生物功能,（一）原核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小
11、亚基分离； mRNA在小亚基定位结合； 起始氨基酰-tRNA的结合； 核蛋白体大亚基结合。,IF-3,IF-1,1. 核蛋白体大小亚基分离,目 录,IF-3,IF-1,2. mRNA在小亚基定位结合,目 录,原核生物mRNA在核蛋白体小亚基上的准确定位和结合涉及两种机制：,在各种mRNA起始AUG上游约813核苷酸部位，存在一段由49个核苷酸组成的一致序列，富含嘌呤碱基，如-AGGAGG-，称为Shine-Dalgarno序列(S-D序列)，又称核蛋白体结合位点(ribosomal binding site, RBS)。一条多顺反子mRNA序列上的每个基因编码序列均拥有各自的S-D序列和起始A
12、UG。,几种基因mRNA 上的S-D 序列,小亚基中的16S-rRNA 3-端有一富含嘧啶碱基的短序列，如-UCCUCC-，通过与S-D序列碱基互补而使mRNA与小亚基结合。,mRNA序列上紧接S-D序列后的小核苷酸序列，可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别并结合。,IF-3,IF-1,3. 起始氨基酰tRNA( fMet-tRNAimet )结合到小亚基,目 录,IF-3,IF-1,IF-2,GTP,GDP,Pi,4. 核蛋白体大亚基结合，起始复合物形成,目 录,IF-3,IF-1,IF-2,-GTP,GDP,Pi,目 录,起始复合物形成过程,（二）真核生物翻译起始复合物形成,核蛋白体大小亚
13、基分离； 起始氨基酰-tRNA结合； mRNA在核蛋白体小亚基就位； 核蛋白体大亚基结合。,真核生物翻译起始的特点,真核生物的 mRNA 上没有 SD 序列，但有5 帽子结构，翻译起始过程需要帽子结合蛋白。（cap-site binding protein, CBP）,真核生物翻译起始复合物形成过程,二、肽链合成延长,指根据mRNA密码序列的指导，添加氨基酸从N端向C端延伸肽链，直到合成终止的过程。,肽链延长在核蛋白体上连续性循环式进行，又称为核蛋白体循环(ribosomal cycle)，每次循环增加一个氨基酸，包括以下三步： 进位(entrance) 成肽(peptide bond for
14、mation) 转位(translocation),每轮循环使多肽链增加一个氨基酸残基。,延伸过程所需蛋白因子称为延长因子(elongation factor, EF) 原核生物：EF-T (EF-Tu, EF-Ts) EF-G 真核生物：EF-1 、EF-2,肽链合成的延长因子,又称注册(registration),（一）进位,指根据mRNA下一组遗传密码指导，使相应氨基酰-tRNA进入核蛋白体A位。,目 录,Tu,Ts,GTP,GDP,Tu,Ts,GTP,目 录,进位的反应过程：,（二）成肽,成肽是在转肽酶(peptidase)的催化下，核蛋白体P位上起始氨基酰-tRNA的N-甲酰甲硫氨酰
15、基或肽酰-tRNA的肽酰基转移到A位并与A位上氨基酰-tRNA的-氨基结合形成肽键的过程。,成肽的反应过程,（三）转位,转位是在转位酶的催化下，核蛋白体向mRNA的3-端移动一个密码子的距离，使mRNA序列上的下一个密码子进入核蛋白体的A位、而占据A位的肽酰-tRNA移入P位的过程。,转位需要延长因子EF-G参与。,EF-G有转位酶（translocase）活性，可结合并水解1分子GTP，释放的能量促进核蛋白体向mRNA的3侧移动，使起始二肽酰-tRNA-mRNA相对位移进入核蛋白体P位，而卸载的tRNA则移入E位。,转位的反应过程,延长因子EF-G有转位酶( translocase )活性，
16、可结合并水解1分子GTP，促进核蛋白体向mRNA的3侧移动 。,fMet,fMet,目 录,成肽转位下一轮进位,肽链合成延长(核蛋白体循环)过程,真核生物肽链合成的延长过程与原核基本相似，但有不同的反应体系和延长因子。 另外，真核细胞核蛋白体没有E位，转位时卸载的tRNA直接从P位脱落。,（四）真核生物延长过程,三、肽链合成的终止,当mRNA上终止密码出现后，多肽链合成停止，肽链从肽酰-tRNA中释出，mRNA、核蛋白体等分离，这些过程称为肽链合成终止。,终止相关的蛋白因子称为释放因子 (release factor, RF),一是识别终止密码，如RF-1特异识别UAA、UAG；而RF-2可识
17、别UAA、UGA。 二是诱导转肽酶改变为酯酶活性，相当于催化肽酰基转移到水分子-OH上，使肽链从核蛋白体上释放。,释放因子的功能,原核生物释放因子：RF-1，RF-2，RF-3 真核生物释放因子：eRF,AUG,Met,2,3,4,n,UGA,RF,AUG,Met,2,3,4,n,UGA,AUG,Met,2,3,4,n,UGA,H2N,COOH,AUG,UGA,RF,目 录,肽链合成的全过程,多聚核蛋白体的形成可以使蛋白质生物合成以高速度、高效率进行。,（四）多聚核蛋白体(polysome),1条mRNA模板链都可附着10100个核蛋白体，这些核蛋白体依次结合起始密码子并沿53方向读码移动，同
18、时进行肽链合成，这种mRNA与多个核蛋白体形成的聚合物称为多聚核蛋白体(polysome) 。,多聚核蛋白体(polysome),使蛋白质合成高速、高效进行。,目 录,电镜下的多聚核蛋白体现象,目 录,原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别,蛋白质翻译后修饰和靶向输送Posttranslational Processing & Protein Transportation,第 四 节,从核蛋白体释放出的新生多肽链不具备蛋白质生物活性，必需经过不同的翻译后复杂加工过程才转变为天然构象的功能蛋白。,主要包括,多肽链折叠为天然的三维结构 肽链一级结构的修饰 高级结构修饰,一、多肽链折叠为天然功能构
19、象的蛋白质,新生肽链的折叠在肽链合成中、合成后完成，新生肽链N端在核蛋白体上一出现，肽链的折叠即开始。可能随着序列的不断延伸肽链逐步折叠，产生正确的二级结构、模序、结构域到形成完整空间构象。 一般认为，多肽链自身氨基酸顺序储存着蛋白质折叠的信息，即一级结构是空间构象的基础。 细胞中大多数天然蛋白质折叠都不是自动完成，而需要其他酶、蛋白辅助。,几种有促进蛋白折叠功能的大分子,1. 分子伴侣 (molecular chaperon) 2. 蛋白二硫键异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI) 3. 肽-脯氨酰顺反异构酶 (peptide prolyl cis-tr
20、ans isomerase, PPI),1. 分子伴侣:,分子伴侣是细胞内一类可识别肽链的非天然构象、促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠的保守蛋白质。,分子伴侣有以下功能：,封闭待折叠蛋白质的暴露的疏水区段； 创建一个隔离的环境，可以使蛋白质的折叠互不干扰； 促进蛋白质折叠和去聚集； 遇到应激刺激，使已折叠的蛋白质去折叠。,(1). 热休克蛋白(heat shock protein, HSP) HSP70、HSP40和GreE族 (2). 伴侣素(chaperonins) GroEL和GroES家族,分子伴侣主要有：,热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用 结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行
21、折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。,伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程,伴侣素的主要作用 为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。,2. 蛋白二硫键异构酶,多肽链内或肽链之间二硫键的正确形成对稳定分泌蛋白、膜蛋白等的天然构象十分重要，这一过程主要在细胞内质网进行。,二硫键异构酶在内质网腔活性很高，可在较大区段肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。,3. 肽-脯氨酰顺反异构酶,多肽链中肽酰-脯氨酸间形成的肽键有顺反两种异构体，空间构象有明显差别。 肽酰-脯氨酰顺反异构酶可促进上述顺反两种异构体之间的
22、转换。 肽酰-脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在肽链合成需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。,二、一级结构的修饰,（一）肽链N端的修饰 去除N-甲酰基或N-蛋氨酸 （二）个别氨基酸的修饰 羟脯氨酸，羟赖氨酸，二硫键 （三）多肽链的水解修饰 酶原 活性酶,三、空间结构的修饰,（一）亚基聚合 （二）辅基连接 （三）疏水脂链的共价连接,肌红蛋白和血红蛋白的结构,蛋白质合成后需要经过复杂机制，定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位，这一过程称为蛋白质的靶向输送。,四、蛋白质合成后的靶向输送,胞浆 蛋白质的目标 细胞器 体液 靶向输送首先进入内质网，再被包装进分泌小泡转
23、移、融合到其它部位或分泌出细胞,分泌性蛋白,（一）分泌蛋白的靶向输送,真核细胞分泌蛋白等前体合成后靶向输送过程首先要进入内质网。,信号肽(signal peptide),各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。信号序列是决定蛋白质靶向输送特性的最重要元件，提示指导蛋白质靶向输送的信息存在于蛋白质自身的一级结构中。,N-端含1个或几个带正电荷的碱性氨基酸残基，如赖氨酸、精氨酸； 中段为疏水核心区，主要含疏水的中性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸等； C-端加工区由一些极性相对较大、侧链较短的氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸）组成，紧接着是被信号肽酶(signal peptidase)裂解的位
24、点 。,信号肽有以下共性：,真核细胞分泌型蛋白质的靶向输送过程为：核蛋白体上合成的肽链先由信号肽引导进入内质网腔并被折叠成为具有一定功能构象的蛋白质，在高尔基复合体中被包装进分泌小泡，转移至细胞膜，再分泌到细胞外。,（二）分泌型蛋白质由分泌小泡靶向输送至胞外,信号肽识别粒子（SRP）,六种蛋白及一个RNA组成,7s,信号肽引导真核分泌蛋白进入内质网,目 录,（二）线粒体蛋白的靶向输送,目 录,绝大部分线粒体蛋白质是由核基因组编码、在胞液中的游离核蛋白体上合成后释放、靶向输送到线粒体中的。,（三）细胞核蛋白的靶向输送,目 录,在胞液中合成后经核孔靶向输送入核,蛋白质生物合成的干扰和抑制Inter
25、ference & Inhibition of Protein Biosynthesis,第 五 节,蛋白质生物合成是很多天然抗生素和某些毒素的作用靶点。它们就是通过阻断真核、原核生物蛋白质翻译体系某组分功能，干扰和抑制蛋白质生物合成过程而起作用的。 可针对蛋白质生物合成必需的关键组分作为研究新抗菌药物的作用靶点。同时尽量利用真核、原核生物蛋白质合成体系的任何差异，以设计、筛选仅对病原微生物特效而不损害人体的药物。,一、许多抗生素通过抑制蛋白质生物合成发挥作用,抗生素(antibiotics)是一类由某些真菌、细菌等微生物产生的药物，有抑制其他微生物生长或杀死其他微生物的能力，对宿主无毒性的抗
26、生素可用于预防和治疗人、动物和植物的感染性疾病。,抗生素类,1. 四环素和土霉素等，它能特异结合A位，抑制氨基酰-tRNA 与原核细胞的核蛋白体结合，阻碍进位。,2. 氯霉素：能与原核生物的核蛋白体大亚基结合，抑制转肽酶，阻断翻译延长过程。 3. 链霉素和卡那霉素：能与原核生物的核蛋白体小亚基结合，改变其构象，抑制起始。,结构与酪氨酸-tRNA相似，影响肽键形成易脱落,作用原核、真核,抗肿瘤,抗生素抑制蛋白质生物合成的原理,二、其他干扰蛋白质生物合成的物质,（一）毒素,某些毒素能在肽链延长阶段阻断蛋白质合成而呈现毒性，如白喉毒素是真核细胞蛋白质合成的抑制剂，它作为一种修饰酶，可使eEF-2发生
27、ADP糖基化共价修饰，生成eEF-2腺苷二磷酸核糖衍生物，使eEF-2失活。,1白喉毒素(diphtheria toxin),白喉毒素的作用机理：,白喉毒素,+,+,（二）干扰素,干扰素(interferon, IFN)是真核细胞被病毒感染后分泌的一类具有抗病毒作用的蛋白质，可抑制病毒的繁殖。 干扰素分为-（白细胞）型、-（成纤维细胞）型和-（淋巴细胞）型三大类，每类各有亚型，分别具有其特异作用。,干扰素抑制病毒的作用机制有两方面,干扰素在某些病毒双链RNA存在时，能诱导特异的蛋白激酶活化，该活化的蛋白激酶使eIF-2磷酸化而失活，从而抑制病毒蛋白质合成； 干扰素能与双链RNA共同活化特殊的2-5寡聚腺苷酸（2-5A）合成酶，催化ATP聚合，生成单核苷酸间以2-5磷酸二酯键连接的2-5A，经2-5A活化核酸内切酶RNase L，后者可降解病毒mRNA，从而阻断病毒蛋白质合成,干扰素的作用机理,1. 干扰素诱导eIF2磷酸化而失活,2. 干扰素诱导病毒RNA降解,
